روش‌هاي انجام عمليات صحرايي و آزمايشگاهي در حشره‌شناسي پزشكي 

تهيه و تنظيم:

مهندس احمدعلي حنفي ‌بجد

كلياتي در مورد روش‌هاي مطالعه بندپايان مهم پزشكي در شرايط آزمايشگاهي و صحرايي

1. جمع‌آوري، نگهداري و كار با نمونه

هر متخصص حشره‌شناسي پزشكي، در حين انجام تحقيقات صحرايي مجبور به صيد كردن نمونه‌ها و كار با آنهاست. اين كار معمولاً شامل جمع‌آوري و نگهداري نمونه‌ها با روش‌هاي خاصي است كه عمدتاً، و گاهي اوقات تنها روش‌هايي هستند كه براي مطالعه گروه خاصي از بندپايان به كار مي‌روند. اين روش‌ها براي گروههاي مختلف حشرات مهم پزشكي و همچنين در نقاط مختلف، متفاوت هستند. بنابراين، در ذيل به شرح برخي از نكات اساسي در اين مورد مي‌پردازيم و روش‌هاي تخصصي در فصل مربوط به هر گروه ارائه گرديده است.

اصول جمع‌آوري نمونه و كار با آن

لوازم جمع‌آوري

اين وسايل از ساده‌ترين ابزار، از قبيل توري‌هاي حشره‌شناسي و لوله‌هاي صيد، تا تله هاي بسيار تخصصي كه براي اهداف خاصي به كار مي‌رود، متفاوتند. نمونه‌گيري عبارتست از جمع‌آوري نمونه‌ها با يك روش استاندارد به منظور انجام مطالعه كمّي، كه در آن مي‌توان از ابزار بسيار متفاوتي استفاده نمود. در اين قسمت فقط برخي از نكات ساده و اساسي كه به صورت روتين مورد استفاده بوده و براي صيد لازم هستند، مورد بررسي قرار گرفته‌اند. انواع مختلف تله‌ها براي صيد حشرات به منظور انجام تحقيقات خاص به كار رفته‌اند. برخي از آنها حشرات را به صورت انفرادي و از طريق مكانيكي به دام مي‌اندازند مثل تله‌هاي مكنده)، در حاليكه سايرين با استفاده از مواد جلب كننده از قبيل نور، دي‌اكسيدكربن و يا بوي بدن ميزبان آنها را صيد مي‌كنند.

توري‌هاي حشره‌شناسي دستي (شكل 1) معمولاً شامل يك كيسه ساخته شده از توري‌هاي داراي سوراخ‌هاي ريز هستند كه به دور يك قاب دايره‌اي متصل گرديده است. اين قاب از جنس آلومينيوم بوده و طوري طراحي شده كه مي‌توان در موقع عدم استفاده، آن را از هم جدا نمود. به دليل ريز بودن جثه اكثر حشرات و بندپايان مهم پزشكي، توري‌ها معمولاً در حشره‌شناسي پزشكي ارزش محدودي دارند. با وجود اين، در مورد جمع‌آوري پشه‌ها از طريق حركت جارويي بر روي رويش گياهي و صيد مگس‌هاي تسه‌تسه از روي ميزبانهايشان، از آن‌ها استفاده مي‌شود. هدف صيد، مشخص كننده نوع مناسب توري است. در مورد حشرات مهم پزشكي، كار با كيسه‌هاي توري سفيد راحت تر است، در حالي كه براي جمع‌آوري پروانه‌ها توري سياه طرفدار بيشتري دارد.

وسيله جمع‌آوري مهم ديگر در حشره‌شناسي پزشكي، آسپيراتور است (شكل 2). اين وسيله كه انواع مختلفي هم دارد، براي جمع‌آوري پشه‌ها و پشه‌خاكي‌ها از اماكن استراحتشان و حتي براي جمع‌آوري اكتوپارازيت‌هايي كه وادار به ترك ميزبانهايشان مي‌شوند، مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

آسپيراتورها وسايل ساده، ولي مؤثري هستند كه حشرات كوچك را از طريق مكيدن به داخل، صيد مي‌كنند. عمل مكش هوا هم توسط دهان فرد جمع‌آوري كننده و هم با وسايل حبابي شكل پلاستيكي صورت مي‌گيرد. در برخي موارد هم فَن‌هاي كوچكي كه با نيروي باتري كار مي‌كنند، اين عمل را به عهده دارند. ساده‌ترين نوع آسپيراتور، يك لوله شيشه‌اي يا پلاستيكي شفاف به طول حدود 25 سانتيمتر است كه يك توري بر روي يك انتهاي آن قرار گرفته و بر روي توري يك لوله بلند قابل انعطاف متصل شده است. انتهاي ديگر لوله پلاستيكي قابل انعطاف در دهان فرد جمع‌آوري كننده قرار مي‌گيرد و با عمل مكش هوا، حشرات را مي‌توان به سادگي درون لوله شيشه‌اي كشيد.

نوع ديگر آسپيراتور داراي يك قسمت شيشه‌اي يا لوله پلاستيكي به طول حدود 15-10 سانتيمتر است كه دو انتهاي آن توسط يك درپوش مسدود شده‌اند. يك لوله شيشه‌اي باريك كه در هر دو انتها باز است از اين درپوش عبور داده مي‌شود. در كنار اين لوله يك لوله پلاستيكي وجود دارد و حشرات از طريق انتهاي لوله باريك ديگري وارد محفظه مي‌شوند. يك تكه توري كه روي انتهاي داخلي لوله مكش قرار دارد، جلوي ورود نمونه‌ها را از محفظه به داخل حلق فرد جمع‌آوري كننده مي‌گيرد.

بسياري از حشرات مهم پزشكي را مي‌توان حتي بدون استفاده از توري يا آسپيراتور و از طريق قرار دادن يك لوله آزمايش بدون لبه بر روي آنها كه در حال استراحت يا خونخواري هستند، صيد نمود. لوله‌ها يا ويال‌هاي داراي اندازه و شكل مختلف براي اين كار مناسب هستند.

حشرات كوچك مثل پشه‌خاكي‌ها و ميدج‌هاي Culocoidesرا مي‌توان از طريق الكتريسيته ساكن كه در لوله‌هاي پلاستيكي ايجاد مي‌شود، به آنها چسباند و جمع‌آوري نمود؛ به ويژه اين كار را مي‌توان با لوله‌هاي ساخته شده از جنس پلي استيرن شفاف به خوبي انجام داد.

كشتن و نگهداري نمونه‌ها

مهمترين نكته‌اي كه بايد در حين كشتن و نگهداري نمونه مد نظر داشت، ويژگي‌هايي است كه براي تشخيص آن به كار مي‌روند. عدم توجه به اين نكته در هر يك از مراحل اوليه مي‌تواند تعداد زيادي از نمونه‌هايي را كه به دقت جمع‌آوري شده‌اند، غير قابل استفاده سازد. به عنوان مثال، پشه‌ها نبايد در مايعات نگهداري شوند و يا توسط آنها جمع‌آوري گردند؛ زيرا فلس‌هايي را كه بدن و بال‌هايشان را پوشانده از دست خواهند داد و اين كار، تشخيص آنها را تقريباً غير ممكن مي‌سازد. همچنين كيفيت نمونه در بسياري از حشرات و ساير بندپايان در صورتي كه گذاشته شوند تا بميرند، پايين خواهد آمد. براي شناسايي يا ذخيره طولاني مدت به صورت نمونه‌هاي مورد استفاده در شناسايي ساير نمونه‌ها (نمونه‌هاي مرجع)، بايد آنها را از طريق تماس دادن با يكي از تركيبات كشندة استاندارد، كشت. اين مواد شامل استات اتيل، اتر، تتراكلرواتان و كلروفرم هستند كه مي‌توان آنها را روي يك تكه پنبه ريخت و پنبه آغشته را به همراه نمونه در يك بطري يا لوله شيشه‌اي گذاشت. حشرات را مي‌توان از طريق سرما دادن (فريز كردن) نيز كشت (اگر چنين امكاناتي در شرايط صحرايي وجود داشته باشد). همچنين به عنوان آخرين راهكار مي‌توان نمونه‌ها را از طريق تماس با دود سيگار كشت، اما توجه داشته باشيد در اين روش، لوازم به دود سيگار آلوده مي‌شوندو براي جمع‌آوري‌هاي بعدي حشرات به صورت زنده، بايد اين نكته را مد نظر داشت. راه ديگر براي كشتن نمونه‌ها، استفاده از گرماي شديد نور آفتاب است. لاروها را مي‌توان با انداختن در الكل كشت. افراد بالغ بندپايان كوچك را نيز مي‌توان در الكل يا به صورت مونته در لام نگهداري نمود. لاروهاي بزرگ دوبالان (مثل لارو مگس‌هاي موسيده يا كاليفوريده) را به به خوبي در آب جوش مي‌توان كشت. نمونه‌ها در آب جوش شكل خود را حفظ مي‌كنند و چروكيده نمي‌شوند. بخار حاصل از مايعات كشنده بر روي ديواره‌هاي بطري‌ها و لوله‌هاي مرگ، به ويژه در شرايط گرم نواحي گرمسيري، باقي مي‌ماند و رعايت اين نكته مهم است كه نمونه‌ها به محض مردن بايد براي سوزن زدن از شيشه مرگ خارج شوند. نمونه‌ها بايد بلافاصله پس از مرگ، اندازه‌گيري و سوزن زده شوند و يا به روش ديگري ذخيره گردند تا از چروكيده و يا شكننده شدن زياد آنها جلوگيري به عمل آيد. اين عمل به ويژه در مورد هر نمونه‌اي كه در معرض كلروفرم قرار گرفته، بايد انجام شود؛ ‌چون اين ماده كشنده به سرعت بدن حشرات را سفت و شكننده مي‌سازد.

سه روش اساسي نگهداري كه به صورت عمومي مورد استفاده‌اند، عبارتند از: خشك، غوطه‌ور در مايع و مونته در لام.

نگهداري به صورت خشك، براي چندين گروه از بندپايان ناقل (پشه‌ها، مگس‌هاي سياه، مگس‌هاي اسب و مگس‌هاي وزوزو -blowfly-) مطلوب و در برخي موارد ضروري است. اسكلت خارجي سخت بدن آنها اغلب ويژگي‌هاي مرفولوژيكي خارجي خود را حفظ مي‌كند و اين حشرات معمولاً به صورت سوزن زده شده نگهداري مي‌شوند. نمونه‌هاي بزرگ (مثل مگس اسب جنس Tabanus) را مي‌توان مستقيماً با روش‌هاي بالا مونته كرد، اما در مورد نمونه‌هاي كوچك لازم است كه اول روي يك سوزن بسيار ريز سوزن زده شوند و سپس بر روي پايه قرار گيرند. يعني نمونه‌هايي كه با سوزن‌هاي بسيار ريز سوزن زده شده اند؛ روي قطعات كوچكي از موادي از قبيل پلي‌اورتان مونته مي‌شوند و سپس اين قطعات روي يك سوزن حمل كننده بلند فيكس مي‌شوند (شكل 3). براي جلوگيري از خطر آسيب ديدن و شكستن، نمونه بايد در نزديكي وسط سوزن بسيار ريز فيكس شود. گاهي اوقات ديده مي‌شود كه براي مونته نمونه ابتدا سوزن بسيار ريز از پايه بلند عبور داده مي‌شود و سپس نمونه به صورت اريب روي گوشه سوزن بسيار ريز قرار مي‌گيرد. از اين روش هرگز نبايد استفاده شود. ميكروسوزن‌هاي استيل ضد زنگ در چندين اندازه و قطر مختلف، براي نمونه‌هاي با اندازه‌هاي مختلف ساخته شده‌اند. كار با چنين سوزن‌هايي توسط پنس انجام مي‌شود. روش مورد استفاده براي نمونه‌هاي كوچك، چسباندن آنها به قطعات كارت است. از به كار بردن سلولوئيد و يا ساير مواد بايد خودداري شود، چرا كه نمونه‌ها اغلب پس از خشك شدن ماده چسبدار از بين مي‌روند.

نگهداري به صورت مرطوب، براي بسياري از بندپايان مهم پزشكي لازم است و براي حشرات در مرحله لاروي متداول مي‌باشد. بعضي از حشرات بالغ (مثل اكتوپارازيت هايي از قبيل كك‌ها و شپش‌ها) و كنه‌ها به اين روش نگهداري مي‌شوند. در اين روش، نمونه‌ها بايد در يك مايع كه از متلاشي شدن آنها جلوگيري مي‌كند (اتيل الكل يا اتانول) قرار داده مي‌شوند. از ساير مايعات نگهدارنده مي‌توان به فرمالين و متيل الكل (متانول) اشاره كرد. با وجود اين، اولي رنگ نمونه‌ها را تغيير مي‌دهد و دومي آنها را ترد و شكننده مي‌سازد. با گذشت زمان، همه مايعات نگهدارنده باعث سفيد و بي‌رنگ شدن نمونه‌ها مي‌شوند؛ اما نگهداري آنها در تاريكي، روند اين كار را كند مي‌سازد. بسياري از انواع لوله‌ها يا ويال‌ها، براي نگهداري نمونه‌ها در اتانول مناسب هستند، اما اين ماده از همه ظروف تبخير مي‌شود؛ حتي اگر درب آن بسته شده و يا يك چوب پنبه در درب آن قرار گرفته باشد. بنابراين، بايد ويال‌ها و لوله‌ها براي امنيت در داخل يكسري جارهاي بزرگتر كه با الكل پر شده و درب آنها كاملاً ‌بسته و درزگيري شده، قرار داده شوند (شكل 4).

تعدادي از بندپايان مهم پزشكي از قبيل: ميدج‌ها، پشه‌خاكي‌ها، كك‌ها و مايت‌ها بايد براي شناسايي و نگهداري طولاني مدت پس از شناسايي، به صورت لام‌هاي ميكروسكوپي مونته شوند. با وجود اين، مي‌توان آنها را به صورت موقتي در الكل هم نگهداري كرد. دو نوع اصلي از مواد مونته كننده وجود دارند:

1. موادي كه محيط سازنده آنها آب است؛ مثل محيط‌هاي برلز و پوري.
2. موادي كه محيط سازنده آنها حلال آلي است؛ مانند كانادا بالزام و اوپارال.

مواد مونته كننده، از نظر شاخص‌هاي انكسار نور تفاوت دارند. بدين معني كه برخي از آنها براي يك گروه از بندپايان، مناسبتر از گروه ديگر هستند. روش‌هاي مونته و تكنيك‌هاي مناسب براي هر گروه در بخش مربوط به هر يك توضيح داده شده‌اند. در صورت مونته نمونه در وضعيت و حالت صحيح، مي‌توان آن را در راحت‌ترين حالت ممكن و با حداقل اتلاف وقت مطالعه كرد و تشخيص داد.

مراقبت از كلكسيون‌هاي حاوي حشرات سوزن زده شده در برابر آفات و قارچ‌ها، به ويژه در نواحي گرمسيري ممكن است كار مشكلي باشد. براي اين كار بايد مراحلي طي شود كه اولين آنها مطمئن شدن از نگهداري نمونه‌ها در جعبه‌هايي است كه تا حد امكان در برابر نفوذ هوا عايق باشند. بدين منظور جعبه‌هاي مخصوصي ساخته شده‌اند كه توصيه مي‌كنيم از آنها استفاده گردد. كيپ بودن درب اين جعبه‌ها، مانع از ورود آفات به داخل جعبه و از بين رفتن نمونه‌ها مي‌شود. آغشتن جعبه با قارچ‌كش (مثل مرتيولات) معمولاً براي جلوگيري از كپك زدن نمونه كافي است، اما براي حفاظت بيشتر در مكان‌هاي به شدت نمور و مرطوب، هر جعبه نگهداري را مي‌توان به صورت محكم و كاملاً عايق، در يك جعبه پلاستيكي حاوي مقداري سيليكاژل پيچيد. يك حشره‌كش (از قبيل ديكلرووس) كه در جعبه‌اي در داخل يك بلوك پلاستيكي كه در قسمتي از جعبه ثابت شده، پاشيده مي‌شود؛ مي‌تواند بسيار مؤثر باشد. اما اين كار بايد به صورت مرتب تكرار گردد.

اطلاعات مربوط به نمونه

نمونه‌هاي فاقد برچسب ارزشي ندارند. بنابراين هر نمونه بايد داراي برچسب‌هايي كه اطلاعات مربوط به محل و زمان صيد نمونه،‌ و ميزبان (در مورد اكتوپارازيت‌ها) در آن درج شده،‌ باشد.

اطلاعات جغرافيايي، بايد شامل كشور، بخش كشور (استان، ‌ناحيه يا شهرستان)، جهت‌يابي با ذكر خصوصياتي از قبيل نام روستا، رودخانه، ارتفاع محل و … باشد.

اطلاعات برچسب بايد ارائه كننده تاريخ صيد بر حسب روز، و همراه نمونه باشند. يعني به سوزني كه نمونه خشك مونته شده به آن متصل است، الصاق گردند؛ يا در زير ويال‌ها (در مورد نمونه‌هايي كه به صورت مايع نگهداري مي‌شوند) قرار گيرند و اگر نمونه‌ها به صورت لام ميكروسكوپي مونته شده باشند، به لام‌ها چسبانده مي‌شوند.

ارسال نمونه‌ها از طريق پست

در صورتي كه براي تشخيص نمونه نياز به يك متخصص باشد، و يا براي ساير مقاصد، از قبيل ارسال نمونه براي قرار گرفتن در يك كلكسيون مرجع، مي‌خواهيد آن را از طريق پست ارسال نماييد؛ نياز به بسته‌بندي خاصي مي‌باشد. متأسفانه بسياري از نمونه‌ها به صورت شكسته شده يا با خسارت‌هاي غير قابل جبران به مقصد مي‌رسند. اين امر تقريباً بيشتر به خاطر بسته‌بندي نادرست و ضعيف آنها مي‌باشد، تا به خاطر اهمال و بي‌دقتي در سرويس‌هاي پستي. از خسارت ديدن نمونه مي‌توان با رعايت احتياطات ساده‌اي جلوگيري به عمل آورد.

نمونه‌هاي موجود در مايعات بايد در داخل ويال‌هاي پلاستيكي يا شيشه‌اي كه داراي يك درب پيچ‌دار هستند، ارسال شوند (مثلاً لوله‌هايي كه در كشت انگل و ميكروبيولوژي كاربرد دارند)، و نبايد در لوله‌هايي كه با چوب پنبه يا قطعات پلاستيكي مسدود شده‌اند، قرار گيرند. در صورتي كه ويال‌هاي شيشه‌اي به دقت بسته‌بندي شوند، امنيت آنها به اندازه انواع پلاستيكي است، اما از هر نوعي كه استفاده مي‌شود، درپوش‌هايشان بايد با چسب بسته شوند، تا خطر تراوش مايع و خشك شدن محتويات لوله كاهش يابد. از ظروف چوبي توخالي موجود در بازار مي‌توان براي پست كردن ويال‌هاي با اندازه‌هاي مختلف، استفاده نمود. هر ويال بايد در داخل اين لوله‌ها با نوارهاي دستمال كاغذي كه در اطراف آن چپانده مي‌شود، در جاي خودش فيكس شود تا نمونه‌ها در حين انتقال تكان نخورند و بدن آنها متلاشي نشود.

براي ارسال پستي حشراتي كه به صورت خشك سوزن زده شده‌اند، بايد آنها را در يك جعبه محكم و تانشو، لاستيكي يا چوبي كه آن هم به نوبه خود در يك كارتن بزرگتر قرار مي‌گيرد، بسته‌بندي كرد. تقريباً همه خسارتي كه به نمونه‌هاي سوزن زده شده در پست وارد مي‌شود، در اثر فقدان يا ضخامت كم و ناكافي بسته‌بندي اطراف آن‌ها و جعبه محتوي نمونه مي‌باشد. حداقل ضخامت 8 سانتيمتر از ماده بسته‌بندي نرم (مثل پلاستيك حباب‌دار)، يا پشم چوب بايد در اطراف هر سطحي حتي يك جعبه نمونه كوچك، و بيشتر براي جعبه‌هاي ذخيره بزرگ مورد استفاده قرار گيرد. فضاي بين نمونه‌هايي كه به صورت سوزن زده شده ارسال مي‌شوند، بايد طوري تنظيم شود كه اگر نمونه‌ها به صورت تصادفي در حين حمل و نقل بچرخند، با يكديگر برخورد نكنند. يك قطعه پنبه بايد در گوشه جعبه قرار داده شود تا قطعات شكسته شده بدن نمونه‌ها در آن گير كنند و به بقيه صدمه نزنند.

محتويات بسته ارسال شده، به صورت متداول روي سطح خارجي آن يا روي هر فرم لازم به صورت “ نمونه براي مطالعه علمي؛ فاقد ارزش تجاري” بايد نوشته شود. اين كار باعث مي‌شود كه در موقع بازرسي گمرك، جعبه را باز نكنند و محتويات آن آسيب نبيند. 

روش‌هاي مطالعه آزمايشگاهي و صحرايي گروههاي مختلف بندپايان مهم پزشكي  

فصل اول

پشه‌ها (Culicidae)

الف) روش‌هاي انجام مطالعات صحرايي

با توجه به اهميتي كه پشه‌هاي زير خانوادة آنوفلينه در انتقال مالاريا دارند، در اين بخش بيشتر روش مطالعه اين گروه از پشه‌ها را توضيح مي‌دهيم. با وجود اين، اكثر روش‌هاي مطالعه را در مورد كوليسينه‌ها هم مي‌توان به كار برد. در موارد خاص هم روش‌هاي مطالعه اين زير خانواده ذكر شده است.

1 – جمع‌آوري تخم پشه‌ها

تخم‌هاي پشه‌ها را مي‌توان به صورت شناور در سطح آب اماكن تخمريزي مشاهده كرد و آنها را به كمك يك كف‌گير يا يك تشتك لعابي كوچك يا عميق‌تر جمع‌آوري نمود. يك روش ساده براي جمع‌آوري تخم‌ها استفاده از دستكش‌هاي Barbe است (دستكشي كه انگشت شست آن جدا و ساير انگشتان آن با هم يكي است). اين دستكش كه از ململ سفيد يا ساير پارچه‌هاي متخلخل كه داراي بافت محكمي است ساخته شده، به دست چپ پوشيده مي‌شود (شكل1). آب جمع‌آوري شده در ظرف يا ملاقه، كم‌كم از قسمت كف دست دستكش عبور داده مي‌شود. هر لكه سياه مشكوك كه بر روي سطح سفيد باقي‌مانده، مورد بررسي قرار مي‌گيرد. پس از كسب مقداري تجربه در اين روش، تشخيص تخم‌ها از مواد ديگر كار آساني خواهد بود. به منظور انجام مطالعات بيشتر بايد تخم‌ها را جدا كرد و روي كاغذ صافي مرطوب گذاشت و آنها را درون لوله‌هاي شيشه‌اي كوچك درپوش‌دار به آزمايشگاه منتقل نمود. پارچة سفيد را مي‌توان درون قاب‌هاي مخصوص گلدوزي و يا ساير وسايل مشابه، به صورت محكم ثابت كرد. همچنين مي‌توان از آن به جاي دستكش براي تصفيه آب استفاده نمود.

2 – جمع‌آوري لاروها و شفيره‌ها

2 – 1 – لوازم مورد استفاده

از وسايل مختلفي براي جمع‌آوري لاروها يا شفيره‌ها از اماكن لاروي استفاده مي‌شود. نوع اين ابزار بسته به شرايط و ترجيح افراد مختلف از يك ملاقة حشره‌شناسي تا يك ظرف لعابي يا قاشق چيني متفاوت است، اما براي مطالعات مقايسه‌اي بهترين كار استفاده از يك ملاقه استاندارد به ظرفيت حدود 400 ميلي‌ليتر است. بايد قسمت داخلي ملاقه سفيد باشد و يك دريچة توري‌دار كه با يك صفحه از قسمت بيرون محافظت مي‌شود، در يك طرف آن وجود داشته باشد، به طوري كه آب را بتوان بدون از دست دادن لاروها خارج نمود (شكل2). در برخي موارد متصل كردن يك دسته چوبي محكم نشكن به ملاقه مفيد است. اين كار نه تنها دامنه عمل ملاقه را افزايش مي‌دهد، بلكه براي مقابله با حملات موجوداتي از قبيل مارها كه گاه در لابلاي گياهان موجود در اماكن لاروي استراحت مي‌كنند هم مي‌توان از آن استفاده نمود. براي جمع‌آوري نمونه از چاههاي آب مي‌توان از يك توري سنگين مخروطي شكل استفاده نمود (شكل3). در اين روش بايد اين توري را كاملاً در داخل قسمت وسط سطح آب فرو برد و سپس از قسمت كناري ديوار چاه بالا كشيد (شكل4). يك وسيله مناسب ديگر براي استفاده در چاهها يك ملاقه متصل به يك دسته بلند است. زاويه اتصال اين دسته با ملاقه كم است و يك پيچ شستي شكل دارد كه به كمك آن مي‌توان ملاقه را در يك زاويه مناسب جهت استفاده تنظيم كرد.

براي خارج كردن لاروها و شفيره‌ها از ملاقه، مي‌توان از يك پيپت دهان گشاد مانند يك قطره چكان معمولي پزشكي كه انتهاي باريك آن بريده شده، استفاده كرد. تعدادي بطري براي حمل شفيره‌هاي صيد شده به آزمايشگاه لازم است. بدين منظور جارهاي 250 سي‌سي Mason كه سيم‌هاي فنري براي قرار دادن يك پوشش روي آن دارد، مفيد است؛ زيرا آنها را مي‌توان به سهولت روي كمربند بست. بر روي هر جار بايد يك برچسب كوچك كه روي آن تعداد صيد نوشته مي‌شود، چسباند. همچنين براي هر مكان لاروي كه از آن نمونه‌گيري به عمل مي‌آيد، بايد يك بطري جداگانه تهيه گردد. بطري‌ها بايد تا حدود ظرفيتشان از آب همان زيستگاه لاروي كه نمونه از آن جمع‌آوري شده، پر شوند.

برخي از محققين ترجيح مي‌دهند كه نمونه‌هاي جمع‌آوري شده خود را در ظروف شيشه‌اي درپيچ‌دار كوچك قرار دهند و آنها را درون يك كمربند حجره‌دار حمل كنند. در غير اين صورت بايد از يك جعبه استفاده كرد و بهترين وسيله براي اين كار جعبه‌هاي چوبي يا پلاستيكي است كه يك صفحه سوراخ‌دار در كف آن قرار دارد و بطري‌ها را مي‌توان در داخل آنها قرار داد. در صورتي كه وسيله حمل و نقل و جابجايي وجود نداشت، مي‌توان از يك كيف مخصوص وسايل نقاشي استفاده نمود (شكل5). پوتين‌ها يا چكمه‌هاي پلاستيكي، يك قطب نما، يك چاقوي بلند و يك دفترچه يادداشت مناسب نيز از ديگر وسايل لازم به شمار مي‌روند.

2-2- روش ملاقه‌زني

بايد در نظر داشت كه لاروها و شفيره‌هاي آنوفلينه معمولاً در سطح اماكن لاروي يافت مي‌شوند، مگر اين كه در اثر تلاطم آب، سايه و يا تكان خوردن رويش گياهي يا وسيله‌اي كه به آن چسبيده‌اند، برآشفته شوند. آنها در موقع احساس خطر به سمت پايين حركت مي‌كنند و ممكن است به مدت چندين دقيقه مخفي باقي بمانند. بنابراين اغلب بايد تلاش كرد تا بتوان آنها را قبل از اين كه برآشفته شوند، در سطح آب به كمك ملاقه صيد نمود (شكل‌هاي6و7).

موقعي كه منطقه تخمريزي روباز است، ملاقه بايد در سطح آن (مثل كف‌گير) حركت داده شود، به طوري كه لبه آن دقيقاً‌ در زير سطح آب قرار گيرد. اما موقعي كه لاروها در لابلاي ساقه‌هاي گياهان وجود دارند، يا به برخي از وسايل شناور چسبيده‌اند، يا در كناره مخزن قرار دارند، از روش مكيدن استفاده مي‌شود. در اين مورد آب سطحي با كج كردن لبه ملاقه در زير سطح آب با فشار وارد آن شده و لاروها به كمك آن بيرون كشيده مي‌شوند. نبايد ملاقه را بي‌هدف در اماكن تخمريزي چرخاند، بلكه بايد حركات قطعي و واضحي انجام داد. اگر ملاقه بيش از حد پر شود، بسياري از لاروها ممكن است از آن خارج شوند. اگر آب گل آلوده (تيره) و يا مملو از گياهان كوچك يا آشغال باشد، مي‌توان از پيپت براي خارج كردن لاروها از آب درون ملاقه استفاده نمود.

قبل از ملاقه‌زني مي‌توان از پاروهاي كوچك براي به هم زدن سطح آب استفاده كرد. آب گل آلوده زمينه‌اي را فراهم مي‌كند كه لاروها را پس از چند لحظه مي‌توان به سهولت در آن مشاهده نمود و تك‌تك آنها را به كمك پيپت يا قاشق مخصوص صيد كرد. براي جمع‌آوري لاروها از سوراخ‌هاي تنه درختان مي‌توان از يك پيپت بلند كه به يك حباب مكنده متصل است، استفاده نمود. اگر سوراخ تنه درخت خشك باشد، مي‌توان مقداري از مواد باقي‌مانده در آن را جمع‌آوري كرد. سپس در صورتي كه مواد مذكور در آزمايشگاه قرار داده شوند، ممكن است لارو از آنها بيرون بيايد؛ چرا كه گاهي اوقات مرحلة تخم در گونه‌هايي كه درون سوراخ درختان تخمريزي مي‌كنند، به خشكي مقاوم است و پس از يك دوره خشكي با فراهم شدن آب به لارو تبديل مي‌شود.

در جمع‌آوري لاروهاي مانسونيا لازم است كه گياه Pistia يا ساير گياهاني كه اين لاروها به آن مي‌چسبند، بيرون كشيده شوند و از نظر وجود لارو بر روي ساقه يا ريشه مورد بررسي قرار گيرند. لاروهاي موجود بر روي آنها بايد به كمك آب به داخل يك ظرف لعابي شسته و منتقل شوند. با يافتن تعداد كمي از لاروهاي سنين اول نمي‌توان يك محل را به عنوان يك مكان تخمريزي معرفي كرد، چرا كه معلوم نيست اين لاروها بتوانند دوره زندگي خود را تحت اين شرايط به پايان برسانند و به فرد بالغ تبديل شوند. بايد شك كرد كه اين مكان ممكن است براي گونه موجود در آن يك زيستگاه لاروي تا حدي حائز اهميت باشد.

اگر 10 ملاقة زده شده در يك متري لبة زيستگاه لاروي عاري از لارو باشد، مي‌توان آن محل را تحت عنوان منفي در زمان بررسي قلمداد كرد. بايد توجه داشت كه نتايج منفي گاهي اوقات ممكن است مربوط به بي‌تجربگي فرد جمع‌آوري كننده، استفاده از سموم لاروكش‌ در محل، تغييراتي كه اخيراً در ميزان آب محل صورت گرفته، يا علل ديگري باشد. بنابراين، محلي كه منفي بود، الزاماً نبايد از بازديدهاي بعدي حذف شود.

جمع‌آوري لاروها و شفيره‌ها مستلزم تمرين و تجربه بوده و جمع‌آوري از آب گاهي بدون ورود به آن غير ممكن است. سرانجام، شخص نبايد هميشه به ظاهر كلي يك مكان اعتماد كند و ملاقه‌زني را فقط در زماني كه اين محل را مناسب تشخيص داد انجام دهد. گاهي اوقات، به ويژه در فصول خشك، لاروها در مكان‌هاي غير طبيعي يافت مي‌شوند.

2-3- نمونه‌گيري اختصاصي

در صورت انجام مطالعات كمّي، بايد لاروهاي سنين مختلف به صورت جداگانه شمرده شوند. تعداد ملاقه‌ها هم بايد ثبت گردد. همچنين ثبت زماني كه صرف ملاقه‌زني شده نيز مفيد است. بر اساس مطالعات انجام شده، مشخص گرديده كه همبستگي خوبي بين لگاريتم‌هاي ميزان صيدهاي لاروي ماهيانه و همچنين عامل جمع‌آوري منطقه‌اي كه در آن ملاقه‌زني انجام شده، با زماني كه صرف ملاقه‌زني شده وجود دارد. نتايج اين مطالعات نشان داده كه محاسبه يك نسبت ساده، يعني لاروهاي صيد شده تقسيم بر دقايقي كه صرف ملاقه‌زني شده، بهترين معيار براي محاسبه تراكم لاروها در يك مكان لاروي است.

يك روش ديگر براي انجام مطالعات كمي به شرح زير است:

واحدهاي 1-5/0 متر مربعي سطح آب را در قاب‌هاي تخته‌اي به عمق 15 سانتيمتر محصور مي‌كنند. تمام لاروهاي موجود در اين قسمت جمع‌آوري و به دقت تفكيك مي‌شوند. نتايج بدست آمده را مي‌توان به عنوان تراكم در واحد سطح بيان كرد و وفور نسبي لاروهاي مختلف را به صورت جدول ارائه داد. اين روش به ويژه در جايي كه مواد شناور در سطح آب زياد هستند و يا جايي كه رويش گياهي بسيار متراكمي دارد، توصيه مي‌شود.

از قوطي‌هاي حلبي با مساحت قاعده 10 تا 15 سانتيمتر مربع هم مي‌توان استفاده كرد. اين ظروف بايد در هر دو انتها باز باشند و طول كافي براي اين كه آنها را بتوان در حين مطالعه در كف زيستگاه لاروي قرار داد، داشته باشند؛ ضمن اين كه سطح رويي آن بالاتر از سطح آب قرار گيرد. طول اين وسايل از 10 تا 30 سانتيمتر براي استفاده در آب‌هاي داراي عمق مختلف فرق مي‌كند. اين قوطي‌هاي حلبي با كمترين ايجاد آشفتگي در زيستگاه لاروي در كف آن گذاشته ‌شده، تعداد لاروها و شفيره‌هاي موجود در آنها شمرده مي‌شوند و متوسط آنها در واحد سطح بر‌آورد مي‌گردد (شكل 8). گاهي اوقات در موقعي كه از چنين قوطي‌هاي حلبي براي تخمين تعداد لاروها استفاده مي‌شود، مي‌توان توري‌هايي را در بالاي اين ظروف نصب نمود تا افراد بالغي را كه از آن زيستگاه لاروي خارج مي‌شوند، شناسايي كرد. بدين منظور، يك توري كه منطقه‌اي به وسعت 180 سانتيمتر مربع و ارتفاع حدود 150 سانتيمتر را مي‌پوشاند، ‌مناسب به نظر مي‌رسد. لبه‌هاي زيري توري بايد از مواد سنگين ساخته شده، با يك قاب چوبي به سمت پايين كشيده شده، و محكم در گل كف محل فرو برده شود. يك ورودي مناسب براي هر يك از اين محفظه‌هاي توري تعبيه شده و به دقت پس از هر بازديد مسدود مي‌گردد. درب‌هاي زيپ‌دار براي اين كار مناسب هستند. بايد مطمئن شد كه هيچ عنكبوت يا سنجاقكي درون توري وجود نداشته باشد تا به شكار پشه‌ها بپردازد. اين توري‌هاي را بايد هر روز بلافاصله پس از طلوع آفتاب به مدت 2 هفته يا بيشتر بازديد كرد و بالغين متولد شده را جمع‌آوري و شمارش نمود (شكل9).

استفاده از قوطي‌هاي حلبي شمارش و توري‌هاي خروجي بالغين، گاهي اوقات حقيقت مهمي را نشان مي‌دهد. بدين ترتيب كه هيچ تضميني وجود ندارد تا يك جمعيت زياد از لاروها، يك جمعيت زياد افراد بالغ را توليد نمايد. بنا به دلايل متعدد درصد بالايي از لاروها ممكن است نتوانند به شفيره تبديل شوند.

از ساير وسايل مي‌توان به تله‌هاي اتوماتيك اشاره كرد. اين وسيله شامل يك لوله، قيف مخروطي، تغليظ كننده (كنسانتره كننده)‌ و سطل است. موقعي كه لوله در موقعيت خاص خود قرار داده مي‌شود، لاروها به كف آن مي‌روند. سپس قيف در داخل لوله در نزديكي برجستگي كف آن قرار داده مي‌شود. در مدت 10 تا 20 دقيقه لاروهاي محصور در قسمت زيري قيف داخل شده و از طريق مجراي انتهايي آن به لوله وارد مي‌شوند. تغليظ كننده يك لوله مخروطي نوك تيز است كه قسمتي از آن از طرف بالا در لوله اولي فرو مي‌رود. ديواره‌هاي آن چهار مجراي پوشيده با توري به اندازه 8 مش در هر سانتيمتر دارند كه به لاروها اجازه عبور مي‌دهد. همچنين سطل داراي 4 سوراخ جانبي است كه با توري 60 مش پوشيده شده است. يك آستين توري هم در بالاي تغليظ كننده نصب مي‌شود.

يك چوب پنبه در سوراخ قيف قرار داده مي‌شود، سطل به تغليظ كننده چسبيده و تغليظ كننده به لوله متصل شده است. تله توسط دستگيره‌ها آويزان ‌شده، بالا برده و سپس وارونه مي‌شود تا خشك گردد. سپس سطل را خارج كرده پيچ‌هايش را باز مي‌كنند و محتويات آن را در يك جار 2 اونسي مي‌ريزند. لاروهاي بدست آمده از اين روش را مي‌توان در شرايط صحرايي يا آزمايشگاه شمارش نمود.

3 – انتقال لاروها

لاروهاي زنده آنوفلينه را مي‌توان با رعايت دقت كافي تا فواصل قابل ملاحظه‌اي انتقال داد. جارهاي 250 سي‌سي كه در بالا ذكر شدند و تا آنها پر از آب مي‌شود و مقداري جلبك به آن افزوده مي‌گردد، بدين منظور بسيار مناسب هستند. در صورتي كه ظرف بهتري در دسترس نبود، مي‌توان ني‌هاي موجود در مكان لاروي را به صورت ظروف مناسب بريد و مورد استفاده قرار داد.

اگر وسيله نقليه براي اين كار داراي تكان زيادي باشد، بايد آب را روي يك توري يا پارچه پاشيد تا لاروهايي را كه به قسمت لبه‌هاي ظرف رفته‌اند، مرطوب نگه دارد. آنها در اين صورت چندين ساعت زنده مي‌مانند و شرايط بهتري را نسبت به موقعي كه در آب متلاطم فرو مي‌روند، خواهند داشت.

براي انتقال در فواصل دورتر، يا براي انتقال لاروها از طريق پست، استفاده از يك چوب پنبه منفذ‌دار، همانند آنچه كه در شكل 10 نشان داده شده، الزامي است. با پر كردن بطري تا يك ارتفاع معين، اكسيژن لازم براي لاروها فراهم مي‌گردد و همزمان از هر گونه نشط احتمالي آب، صرف‌نظر از وضعيتي كه بطري ممكن است در آن قرار داده شود، جلوگيري به عمل مي‌آيد.

استفاده از جعبه‌هاي فلزي را كه هر كدام با يك پارچه مرطوب (براي انتقال بدون آب لاروهاي زنده) پوشانده شده، توصيه مي‌گردد. توري‌هاي فلزي براي جدا كردن جعبه‌هايي كه در داخل آنها يك ظرف فلزي سبك قرار دارد، استفاده مي‌شوند. اين ظرف را مي‌توان به نوبه خود در يك پارچه مرطوب قرار داد. بخار حاصله از اين پارچه مرطوب، از افزايش بسيار بالاي دما كه در موقع انتقال ممكن است در اثر تابش مستقيم نور آفتاب به جعبه ايجاد شود، جلوگيري مي‌كند. لاروها به صورت رضايت‌بخشي براي چندين روز زنده مي‌مانند و در اين مدت ممكن است تعدادي از آنها به شفيره و سپس به پشه بالغ تبديل شوند.

4 – ايستگاههاي جمع‌آوري

يك بررسي اوليه به منظور صيد و مطالعه لاروهاي آنوفل‌ها در يك منطقه ممكن است لازم باشد. اين كار را مي‌توان از طريق نمونه‌گيري از همه انواع اماكن لاروي آن منطقه و يا در نقاطي از يك منطقه محدود كه در آن لاروها مي‌توانند زنده بمانند، انجام داد. متعاقب اين بررسي مي‌توان منطقه مناسب براي مطالعه در طول فصل فعاليت پشه‌ها، اجراي برنامه كنترل و يا مطالعات مداوم چندين ساله را پيدا كرد. وقتي مشاهدات مستمر چند ساله طراحي مي‌شوند، انتخاب ايستگاههاي جمع‌آوري براي بازديد‌هاي منظم و ملاقه‌زني به روش استاندارد در فواصل مناسب ضروري به نظر مي‌رسد. در بعضي از پروژه‌ها يك نوبت بازديد در هفته ممكن است لازم باشد، در حالي كه در بقيه آنها ممكن است يك نوبت بازديد در هر دو هفته يا حتي هر ماه كافي باشد. به هر حال، در هر مورد داشتن نمونه‌هاي آن محل كه به يك روش صيد شده‌اند، براي مقايسه مفيد است. فرد محقق بايد تلاش كند ايستگاههايي را انتخاب نمايد كه نمايندة منطقه مورد مطالعه يا مشكل موجود باشد. برخي از آبگيرها ممكن است اماكن تخمريزي موقتي باشند، لذا بايد محل‌هايي انتخاب شوند كه در تمام دورة مطالعه آب داشته باشند. در همه اماكن انتخاب شده بايد لارو وجود داشته باشد، مگر اين كه در زمان انجام مطالعه مقدماتي در آنها اقدامات كنترلي صورت گرفته باشد. همه ايستگاهها بايد به خوبي در روي يك نقشه مناسب علامتگذاري شوند و به هر يك بايد يك نام يا شماره داده شود. در موقع انتخاب ايستگاه، فيلد مربوطه نيز بايد به دقت توصيف شود و هر گونه تغييرات معني‌دار با پيشرفت فصل بايد يادداشت گردد. صرف زمان كافي در انتخاب ايستگاههاي جمع‌آوري براي اطمينان از اين كه آيا آنها نمايندة منطقه هستند و آيا نيازهاي يك پروژه خاص را كه براي آن انتخاب شده‌اند تأمين مي‌كنند، به زحمتش مي‌ارزد.

5 – يادداشت‌هاي صحرايي

يادداشت‌هاي صحرايي شامل تاريخ و نوع محل تخمريزي است. در همه موارد، مكان جمع‌آوري بايد به دقت توصيف گردد. بايد يك اسم به محل داده شود، فاصله و جهت آن از يك محل ثابت از قبيل يك جاده يا يك تير تلفن يا برق، يا يك ساختمان نوشته شود. فرد محقق بايد به خاطر داشته باشد كه لاروها ممكن است به قسمت پايين يك رودخانه يا كانال بروند و يا به مواد شناور در آب بچسبند. به ندرت ممكن است لاروها در اثر يك ريزش ناگهاني يا تلاطم آب به سمت پايين مكان لاروي رانده شوند، اما در چنين مواردي آنها نمي‌توانند در شرايط سخت زنده بمانند.

يادداشت‌هاي بررسي‌ لاروي بسته به نوع پروژه متفاوت هستند. ممكن است شمارش ظروف در صحرا لازم باشد، كه به اين امر توجه كمي در دفترچه يادداشت مربوط به ويژگي‌هاي محل تخمريزي معطوف مي‌گردد. در صورت لزوم، شمارش و شناسايي لاروها بايد در آزمايشگاه انجام شود. براي ساير مطالعات، گاهي اوقات جزئيات صحرايي بيشتري لازم است كه مي‌توان آنها را در يك دفترچه يا روي كارت‌هاي جمع‌آوري يادداشت نمود. يك كارت سوراخ‌دار در برگيرنده هر دوي نكات قابل يادداشت مطالعات فيلدي و آزمايشگاهي در مورد جمع‌آوري لاروي و همچنين براي آناليز داده‌ها،‌ بدين منظور تهيه شده است (شكل‌هاي11و12). اين كارت داخل يك پوشه به صحرا برده مي‌شود و اطلاعات مربوطه را وارد آن كرده و يا بر روي آن كنترل مي‌نمايند. متعاقباً در آزمايشگاه نتايج شمارش و شناسايي به آنها اضافه مي‌شود. سوراخ‌هاي مربوطه پانچ شده‌اند و اطلاعات بدون نياز به كپي يا بازنويسي آناليز مي‌شوند. اين كارت براي پروژه‌هايي كه تعداد جمع‌آوري در آنها نسبتاً بالاست و در نواحيي كه فون آنوفلينه‌ها غني است، طراحي شده‌اند.

پروژه‌ها بسته به اطلاعات مورد نيازشان متفاوت خواهند بود؛ لذا محقق بايد از طرفي از انباشتن اطلاعات غير ضروري و از طرف ديگر از حذف عوامل مفيد خودداري نمايد.

6 – بررسي پشه‌هاي بالغ

پشه‌هاي آنوفل بالغ از نظر رفتار روزانه‌شان تفاوت‌هاي زيادي دارند. روش‌هاي جمع‌آوري مناسب براي يك گونه ممكن است ارزش بسيار كمي براي ديگري داشته باشد و براي يك گونه خاص ممكن است در نواحي مختلف نياز به انجام روش‌هاي متفاوتي باشد. در هر مورد، محقق بايد سعي كند تا اماكن استراحت تيپيك گونه‌هاي محلي تحت مطالعه را قبل از طراحي و استقرار ايستگاههاي جمع‌آوري روتين يا تله‌ها معين نمايد.

در برخي از نقاط، گونه‌هاي ناقل در داخل و اطرف منازل و ساختمان‌ها، در گوشه‌هاي تاريك، توالت‌ها، پشت قاب عكس‌ها و لباس‌ها يا زير مبلمان، قسمت‌هاي پايين ديوار يا روي سقف يافت مي‌شوند. برخي گونه‌ها تقريباً فقط در چنين مكان‌هايي استراحت مي‌كنند (شكل13). سايرين در هر دوي منازل و پناهگاههاي خارجي از قبيل: سوراخ تنه درختان، كانال‌هاي آب زير جاده‌ها و اماكن سايه‌دار يافت مي‌شوند.

اماكن استراحت احتمالي بالغين آنوفل‌ها بسيار زياد و متنوع و شامل خانه‌ها، اصطبل‌ها و محل‌هاي نگهداري حيوانات، اماكن خارجي اطراف ساختمان‌ها، توالت‌ها، مجاري آب زيرزميني، پل‌ها، سوراخ‌هاي تنه درختان، ديوارهاي سنگي خزه گرفته، بريدگي‌هاي زيري سواحل، درزها و شكاف‌هاي درون زمين و … مي‌باشد.

6 – 1 – لوازم مورد نياز

براي صيد پشه‌هاي بالغ لوازم زير لازم است:

چراغ قوه، لوله‌هاي صيد، آسپيراتور، ظروف حمل پشه‌ها، دفترچه يادداشت.

بهترين نوع نور، آن است كه بر روي سر ثابت شود (همانند آنچه كه بر روي كلاه معدنچي‌ها وجود دارد) و باتري آن در داخل جيب قرار مي‌گيرد. اگر از يك چراغ قوه دستي استفاده شود، كارآيي و تمركز شخص پايين مي‌آيد.

انواع مختلفي از لوله‌هاي صيد به منظور جمع‌آوري پشه‌ها مورد استفاده قرار مي‌گيرند. يك لوله آزمايش بدون لبه را مي‌توان پس از مختصري تغييرات به كار برد. دهانه آن به صورت ماهرانه‌اي در اماكن استراحت بر روي پشه‌ها قرار داده مي‌شود و با يك انگشت دهانه آن مسدود مي‌گردد تا پشه به سمت انتهاي لوله برود. يك قطعه پنبه در داخل لوله گذاشته مي‌شود. پس از صيد 4 تا 5 عدد پشه بايد لوله را در ظرف نگهداري خالي كرد و مجدداً نمونه‌گيري را ادامه داد (شكل14). نوع ديگر از لوله‌هاي جمع‌آوري،‌ كه براي مطالعه پشه‌ها استفاده وسيعي دارد،‌ آسپيراتور است. با اين وسيله، پشه را به سادگي مي‌توان با يك مكش هوا به داخل لوله كشيد و سپس آن را به يك لوله آزمايش يا ويال كوچك، و يا در صورت تمايل به يك شيشه كشنده كه براي انتقال به آزمايشگاه مورد استفاده قرار مي‌گيرد، منتقل نمود.

لوله كشنده مناسب براي پشه‌ها، كمي كمتر از 5/2 سانتيمتر قطر و از 10 تا 15 سانتيمتر طول دارد. آن ممكن است از شيشه و يا مواد پلاستيكي ساخته شده باشد. به عنوان ماده كشنده، مي‌توان از سيانيد هيدروژن يا كلروفرم استفاده نمود. در نوع اول مقدار كمي از پودر سيانيد پتاسيم در كف لوله گذاشته مي‌شود و با خاك ارّه با يك ماده متخلخل ديگر روي آن پوشانده مي‌شود. سپس روي آن چند لايه كاغذ خشك‌كن قرار مي‌گيرد و يا با يك لايه گچ پاريس پوشانده مي‌شود. مورد اخير از نظر كار تميزتر و راحت‌تر است، اما موقعي كه عمر بطري به پايان مي‌رسد، آن را نمي‌توان تعويض نمود. لوله كلروفرم را مي‌توان به راحتي از طريق بريدن نوارها يا لوله‌هاي پلاستيكي كهنه، گذاشتن آنها در كف لوله و پاشيدن كلروفرم روي اين خرده ريزه‌ها درست كرد. پلاستيك مقدار زيادي كلروفرم را جذب نموده، سپس آن را به آرامي آزاد مي‌كند. ذرات پلاستيك به كمك يك قطعه پنبه در جاي خود محكم مي‌شوند. سپس يك صفحه چوب پنبه‌اي يا مقوايي روي آن قرار مي‌گيرد. مي‌توان چند سانتيمتر كاغذ لنز ريزريز شده يا يك ماده مشابه ديگر را در هر نوع لوله كشنده گذاشت. اين كار باعث مي‌شود كه پشه‌ها در طي مرحله انتقال، گير بيفتند و شانس فرار آنها كم شود؛ ‌و همچنين از جفتگيري نمونه‌ها با يكديگر كه ممكن است به فلس‌ها، موها، شاخك‌ها و ساير قسمت‌هاي بدن آسيب برساند، جلوگيري به عمل آيد.

حمل تعداد زيادي پشه در يك لوله كشنده، حتي براي يك مدت كوتاه، كار نامطلوبي است، زيرا ممكن است به خاطر رطوبت درون لوله، بال‌ها و پاها به بدن بچسبند. به همين منظور، هر محقق بايد تعدادي از اين لوله‌ها را داشته باشد. همچنين نمونه‌هاي هر ايستگاه جمع‌آوري بايد به صورت جداگانه نگهداري شوند تا اختلالي در ثبت نتايج پيش نيايد. يك فرد جمع‌آوري كننده بايد جعبه‌هاي دارو، قوطي‌هاي حلبي داروها يا ظروف مشابه براي انتقال را داشته باشد تا نمونه‌هاي كشته شده را درون آنها به آزمايشگاه حمل كند. صفحه‌هاي كاغذ صافي (لنز) يا دستمال كاغذي، سطوح عالي براي قرار دادن نمونه‌ها در لابلايشان هستند. قطعات پنبه را مي‌توان براي پر كردن فضاي باقي‌مانده و براي اعمال فشار ملايم به طوري كه نمونه‌ها نتوانند آزادانه به اطراف حركت كنند و به يكديگر صدمه بزنند، مورد استفاده قرار داد.

اغلب حشره‌شناسان ترجيح مي‌دهند كه نمونه‌ها را در تماس مستقيم با پنبه قرار ندهند، چون پاها و شاخك‌هايشان در آنها گير مي‌كند و ممكن است موقعي كه نمونه را خارج مي‌كنند، بشكند. اطلاعات مربوط به زمان و محل صيد و نام فرد جمع‌آوري كننده را مي‌توان مستقيماً روي ظرف نوشت. براي حفاظت نمونه‌ها در برابر قارچ‌ها يا حشرات آفت بايد مقدار كمي كرزوت روي پنبه ريخت يا مقدار كمي بلور نفتالبن در جعبه (كه در تماس با نمونه‌ها نباشد) قرار داد. پس از انجام اين كار حشرات براي هر نوع جابجايي يا براي انتقال از طريق پست آماده‌اند.

پشه‌ها حشراتي كوچك و ظريف هستند و توري‌هاي حشره‌گيري معمولي اغلب براي صيد آنها مناسب نيستند، چرا كه در هنگامي خارج كردن نمونه به آن صدمه مي‌زنند. با وجود اين، استفاده از توري‌هاي حشره‌گيري در بعضي موارد ممكن است مفيد واقع گردد. به عنوان مثال، در فصل خشك (بي‌باران) در جنوب هندوستان، آنوفل كوليسيفاسيس در لبه داخلي بام‌هاي ساخته شده از پوسته‌هاي نارگيل، دور از تابش آفتاب به استراحت مي‌پردازد، در حالي كه در فصل‌هاي ديگر در سطح سقف استراحت مي‌كند. موقعي كه آب حاوي روغن سيترونلاّ يا ساير مواد محرك به صورت مه ريز به سقف پاشيده مي‌شود، پشه‌هاي در حال استراحت بيرون مي‌آيند و مي‌توان آنها را با يك توري دستي صيد نمود. براي انتقال حشرات از توري به لوله بدون وارد شدن صدمه به آنها، تجربه و دقت كافي لازم است.

پشه‌هاي بالغ معمولاً در طول روز جمع‌آوري مي‌شوند، اما گاهي اوقات در شب بر روي ديوارهاي اتاق خواب‌ها، روي توري‌ها يا پشه‌بندها، يا ضمن اين كه حشرات در حال خونخواري روي انسان يا حيوان هستند، مي‌توان آنها را جمع‌آوري نمود.

شلتر‌پيت‌ها از اماكن ديگر براي جمع‌آوري پشه‌ها هستند. اين‌ها گودال‌هايي به عمق 5/1 تا 2 متر، طول 6 تا 7 متر و عرض 1 تا 2/1 متر هستند كه در نزديكي اماكن انساني حفر مي‌شوند. در اين گودال‌ها مي‌توان گونه‌هايي را كه در طول روز در اماكن خارجي به استراحت مي‌پردازند، صيد نمود. در هر جداره اين گودال‌ها حفره‌هايي به ابعاد 30 سانتيمتر حفر مي‌شود. بايد كمي سايه در بالاي اين گودال وجود داشته باشد. پشه‌ها در طول روز در اين حفره كوچك به استراحت مي‌پردازند.

روش ديگر براي بدست آوردن پشه‌ها از پناهگاهها و كلبه‌ها، روش توتال كچ است. در اين روش، از ملحفه‌هاي سفيد براي پوشاندن وسايل موجود در اتاق‌ها استفاده مي‌شود و يك پارچه هم در كف آنها قرار مي‌گيرد. پس از بستن در و پنجره‌هاي اتاق، سمپاشي فضايي با پيرترين يا اسپري‌هاي موجود در بازار انجام شده و پشه‌هاي ناك‌داون شده بر روي ملحفه جمع‌آوري مي‌شوند. در كف سوراخ‌هاي درختان و دالان‌هاي لانه پرندگان و فرو رفتگي‌هاي لبه رودخانه‌ها نيز كاغذ سفيد يا پنبه قرار داده مي‌شود، يك حشره‌كش در داخل آن اسپري ‌شده و دهانه آن براي چند دقيقه مسدود مي‌گردد. سپس پشه‌هاي افتاده بر روي كاغذها جمع‌آوري مي‌شوند.

6– 2– تله‌ها

انواع مختلفي از تله‌ها براي صيد بالغين آنوفلينه طراحي شده‌اند. از اين تله‌ها مي‌توان به تله‌هاي نوراني، تله‌هاي طعمه‌اي و تله پنجره‌اي اشاره نمود.

تله نوراني: اين تله‌ها به اشكال و انواع مختلفي وجود دارند. از تله‌هاي نوراني مي‌توان به تله نيوجرسي اشاره نمود (شكل15). اين تله در جمع‌آوري كوليسينه‌ها مناسب است؛ اما در برخي مناطق، داراي قدرت جلب‌كنندگي براي آنوفلينه‌ها نيست. اين وسيله از يك لوله فلزي كه توسط نوارهاي فلزي عمودي محكم بسته شده و در پايين به پايه‌ها و در بالا به يك قيف مدور فلزي به عرض حدود 40 سانتيمتر متصل مي‌گردد، ‌تشكيل شده است. اين قيف نقش محافظت از تله در برابر باران را به عهده دارد و همچنين همانطور كه در زير توضيح داده شده، به عنوان منعكس كننده عمل مي‌كند. در نوك قيف يك دستگيره فلزي قرار گرفته كه به كمك آن مي‌توان دستگاه را از يك شاخه درخت يا ساير وسايل آويزان كرد. سيم برق در انتهاي قسمت رويي قيف و لامپ در يك فضاي باز قرار گرفته و فن با سرعت متوسط مي‌چرخد. بنابراين حشراتي كه به نور جلب شده‌اند، به سمت پايين كشيده مي‌شوند. يك توري از جنس پارچه سيمي ضخيم در بالاي فن قرار گرفته و فقط به حشرات كوچك اجازه ورود به مخزن را مي‌دهد. در كف قسمت لوله‌اي يك ظرف حاوي سيانيد قرار گرفته است. يك ليوان كاغذي مناسب گاهي اوقات براي جمع‌آوري نمونه‌ها در دهانه قرار داده مي‌شود و حمل آنها را در موقعي كه تله خالي است، راحت‌تر مي‌سازد.

برخي از محققين با وسايلي براي افزايش ميزان CO₂ در جذب پشه‌ها به تله‌ها آزمايشاتي داشته‌اند، چرا كه دي‌اكسيدكربن يكي از عواملي است كه پشه‌هاي ماده را به سوي خود جلب مي‌كند.

بخش‌هاي قابل رؤيت تله نوراني معمولاً به رنگ سبز، قهوه‌اي يا زيتوني خاكستري رنگ‌آميزي مي‌شوند تا با محيط اطراف يكدست گردند. قسمت داخلي قيف بايد سفيد باشد تا به عنوان بازتابنده نور عمل كند. اگر يك زمان براي روشن و خاموش كردن لامپ برق در ساعات خاصي در نظر گرفته شود، ممكن است نياز به ابزار و لوازم بيشتري باشد. محقق مي‌تواند در هر زمان در طول روز تله خود را بازديد كند، اگر چه لامپ فقط در طول ساعات شب كار مي‌كند. نور چراغ گاهي اوقات در ساير روش‌هاي جمع‌آوري كاربرد دارد. از اين موارد مي‌توان به قرار دادن چراغ براي تله‌هاي داراي طعمه حيواني اشاره نمود.

ميزان صيد پشه‌ها در تله نوراني ارتباط مستقيمي با شدت نور دارد. يك استثنا هم در مورد ماده‌هاي كولكس پيپينز كوينكفاسياتوس وجود دارد كه جلب كم آن را به نور در شب‌هاي تاريك نشان مي‌دهد، اما در شب‌هاي مهتابي اين طور نيست. برخي از محققين عقيده دارند كه اثر نور مهتاب روي ماده‌هاي اين گونه به طوري است كه ساير تله‌ها شاخص بهتري از فراواني اين پشه نسبت به تله‌هاي نوراني به دست مي‌دهند. شدت‌هاي زياد نور باعث دفع هيچ گونه‌اي از نور نشده است. در مورد صيد گونه‌هاي مختلف، گاه مي‌توان نوع نور را تغيير داد، چنان‌كه برخي از محققين از نور ماوراء بنفش براي صيد پشه‌ها استفاده نموده‌اند.

تله پنجره‌اي: اين تله (شكل16) وسيله ديگري براي صيد پشه‌هاي بالغ است. اين تله را مي‌توان در پنجره‌هاي سربازخانه‌ها، خوابگاهها، اتاق خواب منازل و .. نصب نمود. پشه‌ها به انسان‌هاي موجود در اين اماكن جلب مي‌شوند، بر روي توري‌هاي پنجره‌ها فرود مي‌آيند و در اغلب موارد به حركت به سمت بالا در جستجوي راه ورود بر روي آن حركت مي‌كنند و از طريق منفذي كه جهت ورود آنها تعبيه شده وارد آن مي‌شوند و به دام مي‌افتند. اين تله را مي‌توان از توري، پارچه ململ، شيشه يا ساير مواد ساخت. تله بايد طوري كار گذاشته شود كه بتوان آن را به سهولت باز نمود. با نصب تله در سمت داخل و يا خارج پنجره، مي‌توان گونه‌هاي اندوفيل، اندوفاژ، اگروفيل و اندوفاژ را شناسايي نمود.

تله طعمه‌اي: تله‌هاي داراي طعمه حيواني در برخي مناطق استفاده محدودي دارند. اين تله‌ها به ابعاد مختلف ساخته مي‌شوند و داراي يك منفذ ورودي هستند. يك حيوان به عنوان طعمه درون آنها قرار داده مي‌شود. پشه‌ها به طعمه داخل تله جلب شده و درون آن به دام مي‌افتند. سقف اين تله‌ها بايد به اندازه كافي محكم باشند تا جلوي نفوذ آب را بگيرد. نصب يك درب در يك يا در هر دو انتهاي تله براي ورود و خروج حيوان طعمه لازم است. نوع حيوان طعمه بسته به ترجيح ميزباني گونه‌اي كه مي‌خواهيم صيد كنيم، متفاوت است. در اين روش نيازي نيست كه فرد جمع‌آوري كننده دائم از تله بازديد نمايد و تا صبح در كنار آن باقي بماند؛ بلكه پس از خارج كردن حيوان، پشه‌ها را مي‌توان از داخل تله جمع‌آوري نمود. برخي از محققين پيشنهاد كرده‌اند سوراخ‌هاي ورودي تلة طعمه‌اي طوري تعبيه شود كه پشه براي فرار مجبور به پرواز به سمت پايين باشد. چنين تله‌هايي تعداد بيشتري پشه از نوعي كه سوراخ‌هايش به صورت افقي قرار دارد، صيد مي‌كند.

7 – انتقال نمونه‌هاي زنده

قاعده كلي در مورد انتقال نمونه‌ها، اجتناب از نگهداري آنها در ظروف و محافظت آنها از خيلي گرم يا خيلي خشك شدن مي‌باشد. ويال‌هاي انفرادي در صورتي كه يك تكه پنبه مرطوب در آنها باشد تا رطوبت مورد نياز پشه را فراهم نمايد، براي اين كار مناسب هستند. با وجود اين، براي تعداد زياد پشه‌ها و به ويژه در مورد انتقال آنها در فواصل دور بايد از قفس‌هاي ساده كه از توري فلزي يا پارچه‌اي درست شده‌اند، استفاده نمود. اين قفس‌ها به ابعاد 15 سانتيمتر مربع يا بيشتر هستند و اندازه مناسبي براي حمل و نقل دارند. يك تكه پنبه در محلول قند 5% خيسانده و بر روي قفس قرار داده مي‌شود تا رطوبت و ماده غذايي مورد نياز پشه‌ها را فراهم نمايد. موقعي كه دما به 29 درجه سانتيگراد مي‌رسد، گذاشتن قفس در يك محل خنك، مثل يخچال‌هاي صحرايي، توصيه مي‌‌شود.

8 – ايستگاههاي جمع‌آوري

اگر مطالعات به صورت مستمر انجام مي‌شوند، ايستگاههاي جمع‌آوري براي پشه‌هاي بالغ را بايد به دقت انتخاب نمود. براي اين كار قواعد و ضوابط صريحي ارائه نشده‌اند و ايستگاه مناسب را بايد بر اساس ويژگي‌هاي رفتاري گونه‌هاي آنوفل مورد بررسي، انتخاب كرد. ممكن است نياز به بازديد منظم منازل خاص، اصطبل‌ها، شكاف‌هاي تنه درختان يا علف‌هاي هرز باشد و در آنها پشه‌هاي بالغ جستجو شوند. گاهي اوقات لازم است كه جمع‌آوري فقط در بخشي از خانه يا اصطبل به ويژه در برخي نقاط مناطق معتدله كه تراكم آنوفل‌ها ممكن است بالا باشد، صورت گيرد. در نواحي گرمسيري معمولاً لازم است كه در تمام كپر يا آلونك به جستجو بپردازيد تا 50 تا 100 آنوفل در حال استراحت به دست آوريد، در حالي كه در برخي از مناطق ممكن است 1000 عدد پشه يا بيشتر را در حال استراحت بر روي سقف يك طويله پيدا كنيد. به منظور مقايسه كمّي پشه‌هاي جمع‌آوري شده، مي‌توان آناليز نتايج را بسته به شرايط محيط، بر اساس زمان صرف شده براي جمع‌آوري آنها از محل تحت جستجو (برحسب دقيقه) انجام داد.

در همه اماكن صيد، متوسط تعداد صيد روي يك رويش گياهي به عنوان نسبت تراكم ماهيانه در نظر گرفته مي‌شود. از محاسبه ميانگين نسبت‌هاي ماهيانه، شاخص فصلي صيد بدست مي‌آيد. برخي از محققين عقيده دارند كه همة بالغين صيد شده در ايستگاه مورد بررسي را بايد پس از انجام شمارش از بين برد. بنابراين، شمارش‌هاي بعدي فقط با جمعيت‌هاي جديد انجام مي‌شود و مي‌توان براي مشخص كردن زاد و ولد مستمر در منطقه بر اين اعداد تكيه كرد.

يك روش ديگر، جمع‌آوري پشه‌ها در 10 دقيقه از ساعت است. تراكم را مي‌توان بر حسب تعداد صيد بر انسان-دقيقه يا بر انسان-ساعت بيان كرد. اين روش بايد براي ارائه پروژه استاندارد شود و در گزارشات به صورت آشكار توصيف گردد.

9 – بررسي اثر حشره‌كش‌ها

اثرات سمپاشي در از بين بردن پشه‌هاي بالغ را مي‌توان از طريق مقايسه نسبت‌هاي فرود آمدن قبل و بعد از سمپاشي در اماكن سمپاشي شده محاسبه نمود.

براي اين كار مي‌توان در محل مورد مطالعه ملحفه‌هايي پهن كرد تا نمونه‌هايي را كه در اثر عمل حشره‌كش به زمين مي‌افتند، روي آنها بيفتند. اين پشه‌ها را مي‌توان در زمان‌هاي مشخص پس از سمپاشي جمع‌آوري كرد و لذا پي به كاهش تدريجي اثر سم برد.

با قفس‌هاي توري‌دار محتوي پشه‌هاي وحشي صيد شده يا پرورش داده شده در آزمايشگاه، كه در نقاط مناسب قرار داده مي‌شوند؛ نيز مي‌توان اثرات سمپاشي در يك منطقه را ارزيابي نمود. گرچه به خاطر اثرات موانع مكانيكي توري سيمي يا پارچه‌اي پيرامون قفس، با استفاده از اين روش ميزان مرگ و مير از روش طبيعي بدون قفس كمتر خواهد بود. تست بيواسي (زيست سنجي) بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهاني نيز براي اين كار صورت مي‌گيرد.

براي ارزيابي اثرات لاروكش‌ها، نمونه‌گيري‌هاي كمّي و شمارش تعداد لاروها قبل از اجراي برنامه كنترل، 24 ساعت پس از انجام آن و در فواصل معين بعدي صورت مي‌گيرد. يك ملاقه به قطر 10 سانتيمتر كه در حدود يك متر از سطح آب حركت داده مي‌شود، را به عنوان نمونه جمع‌آوري شده از 30 سانتيمتر مربع در نظر مي‌گيرند. موقعي كه جمعيت طبيعي لاروها كاهش يافت يا از بين رفت، مي‌توان پراكندگي لاروكش‌ها را از طريق قرار دادن ظرف‌هايي (مثل پتري ديش‌ها) كه تا 8/1 از آب حاوي تعدادي لارو سن 3 يا 4 پر شده‌اند، در نقاط مورد نظر از اماكن لاروي تست كرد.

10 – تهيه نقشه محل

در صورتي كه نقشه‌هاي هوايي تهيه شده از منطقه وجود داشته باشند، بدون شك مناسب‌ترين نوع نقشه براي ارزيابي كار هستند، چرا كه آنها تا حد زيادي اماكن تخمريزي و پرورش لارو را نشان مي‌دهند، در حالي كه در صورت عدم استفاده از اين نقشه‌ها ممكن بود اماكن مذكور به چشم نيايند. نقشه‌هاي مهندسي و آنهايي كه توسط محققين آماده مي‌شوند نيز مفيد هستند، اما اين نوع نقشه‌ها براي بسياري از مناطق مورد نظر مالارياشناسان تهيه نشده يا در دسترس نمي‌باشند. لذا براي بسياري از مناطق بايد خود مالارياشناس بر اساس نيازمندي‌هاي خود يك نقشه تهيه نمايد. بدين منظور بايد اقدامات زير را انجام داد:

10-1- بُعد قدم

قدم يا گام، ساده‌ترين واحد اندازه‌گيري است؛ چرا كه هيچ ابزار تخصصي براي اين كار لازم نيست. افراد بايد براي استفاده از اين روش براساس بعد نقشه مورد نظر مهارت كافي داشته باشند. با توجه به اين كه نقشه‌هاي نظامي معمولاً بر اساس بعد 3 ، 6 ، يا 12 اينچ به ازاي هر مايل تهيه مي‌شوند، مالارياشناس‌ها معمولاً آن را كار آمدتر از نقشه‌هايي خواهند يافت كه هر اينچ روي آن معادل 60، 120، 240 يا 300 متر بوده و جزئيات بر اساس آن نشان داده شده باشد. چنين ابعادي را مي‌توان به سهولت براي اهداف تحقيقي به كار برد. براي يكسان شدن گام‌ها،‌ يك فاصله 450 يا 900 متري بايد بر روي سطح زمين مشخص شود. سپس افراد اين فاصله را چندين نوبت در هر دو جهت با گام‌هاي متوسط قدم كنند. به عنوان مثال با متوسط 510 قدم براي 450 متر، طول متوسط هر قدم حدود 88 سانتيمتر مي‌شود. يك قدم، فاصله پاشنة يك پا تا پاشنه پاي ديگر در راه رفتن معمولي است. هر گام معادل 2 قدم است.

10-2- ابزار نقشه‌كشي

براي اين كار يك ورقه صاف به ابعاد حدود 32×35 سانتيمتر لازم است. اين ورقه بايد با يك گيره كوچك بر روي يك زير دستي به طوري ثابت شود كه جهت شمالي- جنوبي قطب‌نماي مورد استفاده، موازي حاشيه ورقه باشد. كاغذ نصب شده روي سه پايه ارجح است. يك تكه چوب 15 يا 20 سانتيمتري كه مقطع مثلثي دارد (alidade)، و بر روي يك طرف آن فواصل اينچ يا سانتيمتر مشخص شده است از وسايل ديگر مورد استفاده در اين روش مي‌باشد (شكل17). روي لبه ديگر اين چوب كه فاقد درجه‌بندي است، بعد قدم يا گام نقشه‌كش نوشته مي‌شود. كاغذ شطرنجي، يك مداد نرم، ميله نقشه‌كشي (يا يك چوب بلند) مداد پاك‌كن از ديگر ابزار كار به شمار مي‌روند.

10-3- روش نقشه‌كشي – قدم كردن مسير

يك نقطه شروع مانند يك صخره، درخت يا چهارراه يك خيابان را انتخاب كنيد و جهت كاغذ را طوري بگيريد كه يك لبه آن موازي شمال و جنوب مغناطيسي باشد. يك خط روي لبه نقشه براي مشخص كردن شمال و جنوب بكشيد. در همه ايستگاههاي بعدي كاغذ بايد در يك جهت گرفته شود. سپس نقطه شروع را با يك علامت خاص مانند  براي نقطه A ،‌ در شكل18 روي نقشه مشخص كنيد. يك لبه چوب سه گوش را روي نقطه آلفا بگذاريد و در بالاي لبه آن براي يافتن نقطه بعدي مورد نظر (B) نگاه كنيد. اگر هيچ مكان شاخص و بلندي را در نقطه B نديديد كه از آن بتوان به عنوان نشانه استفاده كرد، بايد دستيارتان ميله نقشه‌كشي را در محل مورد نظر نگه دارد. يك خط از آلفا به سمت نقطه B بكشيد، سپس فاصله را قدم كنيد. در نقطه B تعداد قدم‌ها يا گام‌ها روي كاغذ با استفاده از بعد چوب سه گوش مثلثي مشخص مي‌شود و بنابراين نقطه  معلوم مي‌گردد. اين كار را به همين ترتيب ادامه دهيد تا همه نقاط اصلي مشخص شود و سرانجام به نطقه A برسيد. در صورت قدم كردن نادرست نمي‌‌توان انتظار داشت كه نقطه پاياني روي نقشه دقيقاً بر نقطه آلفا منطبق شود. اما اگر اين خطاي نهايي به اندازه‌اي بود كه در شكل18 نشان داده شده، نيازي نيست كه نگران آن باشيد.

مكان‌هاي شاخص نزديك مسير نقشه را مي‌توان با رعايت فاصله آنها با مسير روي نقشه و با قدم كردن، وارد آن كرد. در اين مورد مي‌توان ساختمان‌ها، حوضچه‌هاي اطراف مسير، تيرهاي تلفن و برق و ساير وسايل و مكانهايي كه به سهولت قابل دسترسي و يافتن هستند را وارد نقشه نمود.