بسم الله الرحمن الرحيم

گزارش کارآموزي انگل شناسي و قارچ شناسي

محل کارآموزي :

آزمايشگاه انگل شناسي دانشگاه آزاد اسلامي واحد شبستر

تهيه محلولهاي انگل شناسي

1- محلول نمک اشباع

Nacl 400 گرم را در يک ليتر آب مقطر حل مي کنيم تا اينکه آب اشباع شده و در ته ظرف يک لايه رسوب از نمک تشکيل شود.

2- محلول شکر اشباع (شيتر)

الف. شکر 1500 گرم

ب. آب 960 سي سي

ج. فرمل تجاري 20 سي سي يا کريستال فنل 5/19 گرم

3- روش تهيه رنگ کارمين

الف. به آرامي 45 سي سي اسيد سيتيک گلدسيال را به 55 سي سي آب مقطر اضافه مي کنيم.

ب. پنج گرم پودر کارمين به آن اضافه کرده و محلول را 15 دقيقه مي جوشانيم.

ج. مخلوط را صاف کرده و از کاغذ صافي عبور مي دهيم اين رنگ را مي توان براي هميشه نگهداري کرد.

4- تهيه لاکتوفنل

20 سي سي گليسيرين و 10 سي سي اسيد لاکتيک و 10 سي سي کريستال فنل ذوب شده و 10 سي سي آب مقطر را به خوبي با هم مخلوط مي کنيم.

روش مطالعه نماتودها :

به طور کلي رنگ کردن نماتودها با موفقيت صورت نمي گيرد. زيرا پوست آنها مانع جذب رنگ مي شود. براي مطالعه نماتودها، معمولاً آنها را در گليسيرين و لاکتوفنل شفاف مي کنند. مهمترين ساختمان نماتودها که براي مطالعه و تشخيص آنها ضروري است عبارتند از : پوست و آرايشهاي مختلف آن، لوله گوارش، اندام تناسلي و اسپيکول ها و خارهاي انتهاي قدامي و خلفي.

براي مونته کردن نماتودها اگر چه مي توان از رزين استفاده کرد ولي توصيه نمي شود، زيرا به دليل آب گيري قبلي نتيجه مطلوب بدست نخواهد آمد. از گليسيرين ژلاتين نيز مي توان براي مونته کردن نيمه دائمي نماتودهاي کوچک استفاده کرد.

الف. روش مونته کردن با گليسيرين ژلاتين

وسايل و مواد مورد نياز :

1-    الکل 70% محتوي 5% گليسيرين

2-   ژلاتين دانه اي

3-  گليسيرين خالص

4-   کريستال فنل ذوب شده

روش تهيه گليسيرين ژلاتين

الف- با گرم کردن ملايم 10 گرم ژلاتين را در 60 سي سي آب مقطر حل کنيد.

ب- 70 سي سي گليسيرين و 5% سي سي کريستالهاي ذوب شده فنل را به محلول ژلاتين اضافه کرده و خوب بهم بزنيد.

ج- گليسيرين ژلاتين مايع را درون ظرفهاي شيشه اي با جدار ضخيم و دردار (به حجم 30-15 سي سي) بريزيد و در يخچال نگهداري کنيد.

روش مونته کردن

1-     نماتودها را با محلول الکل 70% حاوي 5% گليسيرين در ظرفهاي کوچکي به عمق چند ميلي متر بگذاريد.

2-    در ظرف را کمي ببنديد تا به مرور زمان الکل و آب موجود در ظرف طي چند روز يا بيشتر تبخير شود. تبخير الکل موجب قرارگرفتن تدريجي نماتودها در غلظتهاي بيشتر گليسيرين خواهد شد. سرانجام نماتودها توسط لايه نازکي از گليسيرين خالص پوشيده خواهد شد. اگر تبخير خيلي سريع انجام شود ممکن است نمونه چروکيده شود هر چه نماتودها ضخيم تر باشد زمان بيشتري براي تبخير لازم است.

3-   نماتود شفاف شده را در ظرف ديگري حاوي لايه نازکي از گليسيرين خالص قرار دهيد تا نماتود کاملاً زير سطح اين لايه قرار گيرد. در عرض چند ساعت به عمق ظرف رسوب خواهد کرد، در اين زمان آماده مونته کردن در گليسيرين ژلاتين است.

4-   ظرف حاوي گليسيرين ژلاتين را در بشر حاوي آب گرم قرار دهيد بطوريکه پس از قرار گرفتن اين ظرف در ته بشر، آب تا نيمه ظرف حاوي گليسيرين ژلاتين بالا آمده باشد بشر را آنقدر گرم کنيد تا گليسيرين ژلاتين به حال مايع درآيد.

5-   يک قطره گليسيرين ژلاتين در مرکز لام ميکروسکوپي بگذاريد و يک يا چند نماتود موجود در گليسيرين خالص را در وسط آن قرار دهيد به اندازه کافي گليسيرين ژلاتين اضافه کنيد تا پس از گذاردن لامل گرد روي آن، گليسيرين ژلاتين تا کناره هاي لامل جريان پيدا کند. ممکن است نماتودهاي کوچک به کناره هاي لامل رانده شود. براي اجتناب از اين کار، اجازه دهيد گليسيرين ژلاتين کمي سفت شده، سپس لامل را اضافه کنيد.

6-    نمونه را يک شب در حالت افقي به حال خود رها کنيد. سپس با لبه تيغ و با احتياط گليسيرين ژلاتين اضافي را بتراشيد. اطراف لامل را با لاک يا انتلن بپوشانيد.

روش ثابت کردن ترماتودها

پس از به حال استراحت درآوردن ترماتودها، به طوريکه پهن شده باشند روي آنها ثابت کننده داغ (60 الي 63 درجه سانتي گراد) اضافه مي کنيم براي پهن کردن ترماتودها بايد آنها را روي لام قرار داده و بر حسب ضخامت روي آنها لامل و يا لام ديگري را           مي گذاريم و درون پليت قرار داده و سپس به آرامي ثابت کننده داغ را طوري اضافه     مي کنيم که نمونه خراب نشود. محلول الکل، فرمالين، اسيدلاکتيک ثابت کننده خوبي براي ترماتدهاست. بايد 24 ساعت پس از ماندن در ثابت کننده اوليه، نمونه را به ثابت کننده اخير و يا الکل گليسيرين منتقل نمود و براي مدت طولاني نگهداري کرد. براي ثابت کردن ترماتودها استفاده از فرمالين توصيه نمي شود. براي مطالعه ترماتودها بايد آنها را با رنگ هاي استوکارمين و يا هماتوکسيلن رنگ کرد، روي لام مونته نمود و زير ميکروسکوپ آزمايش کرد.

روش رنگ آميزي ترماتدها

براي اخذ بهترين نتيجه در رنگ آميزي ترماتودها بهتر است نمونه ها را به مدت زيادي (يک شب يا بيشتر) در محلول رقيق شده کارمين يا هماتوکسيلن قرار دهيم و سپس آنها را بي رنگ کنيم.

براي رنگ آميزي کارمين را قطره قطره به الکل 70% اضافه مي کنيم تا محلول به رنگ صورتي تيره يا نسبتاً تيره درآيد. نمونه ها را با الکل 70% به درون رنگ منتقل کنيد.

روش رنگ گيري :

1-    پس از رنگ آميزي نمونه ها را در الکل 70% مي شوييم.

2-   رنگ اضافي نمونه را با قرار دادن در محلول رقيق اسيد الکل قرار مي دهيم، رنگ نمونه تا آنجا بايد گرفته شود تا تگومنت ترماتود شفاف ولي اندامهاي داخلي به خوبي رنگ را حفظ کنند. ممکن است براي گرفتن رنگ اضافي از چند دقيقه تا چند ساعت لازم باشد. ولي بايد نمونه را مرتباً در زير ميکروسکوپ تشريح و يا ميکروسکوپ نوري بررسي کرد تا زياد رنگ آن زايل نشود. اگر ميزان بي رنگ شدن بيش از حد مطلوب است مجدداً آنرا به داخل رنگ قرار داده و رنگ        مي کنيم.

3-  نمونه ها را چندين بار در الکل 70% مي شوييم.

4-   براي خنثي کردن اسيد، نمونه را 15 دقيقه يا بيشتر در مخلوطي از الکل 70% حاوي 2-1 قطره محلول آبي کربنات سديم و يا کربنات ليتيوم قرار مي دهيم. اگر نمونه را مدت زيادي در محلول خنثي کننده قرار بدهيم نمونه به رنگ آبي درمي آيد. اگر اسيد خنثي نشود رنگ نمونه بر اثر اسيد موجود در آن پس از مونته کردن کاملاً از بين خواهد رفت.

5-   پس از خنثي کردن مجدداً نمونه را در الکل 70% مي شوييم.

6-   آب نمونه را با قرار دادن در الکل 80% و 90% و 96% قرار مي دهيم، بايد نمونه در هر رقت الکل به مدت 4 الي 5 ساعت باقي بماند.

7-  نمونه را به مدت 5 الي 6 ساعت در مخلوط 1 به 1 الکل 96 و زايلون قرار مي دهيم. شفاف شدن نمونه شروع خواهد شد.

8-  براي روشن شدن کامل نمونه آن را در بار مجموعاً به مدت 5 ساعت در زايلون خالص قرار مي دهيم.

9-   نمونه را با استفاده از محلولها (مونته کننده از انتلن و يا بمب دو کانادا) مونته       مي کنيم.

برخي از ترماتودها حين مرحله آبگيري و يا شفاف شدن تمايل به پيچ خوردن دارند، در اين صورت بايد در مراحل فوق بسته به ضخامت ترماتود روي آن لامل يا لام ميکروسکوپي قرار داده محلولها را به آرامي عوض کنيد تا کرمهاي پهن شيده خراب نشوند.

روش مطالعه و مونته کردن سستودها نيز مثل روش مطالعه و مونته کردن ترماتودها مي باشد.

روش مونته کردن بندپايان

ابتدا براي اينکه لايه کوتيکولي آنها از بين برود آنها را در محلولهاي غليظ KOH حرارت مي دهيم تا کاملاً شفاف شوند و سپس آنها را براي آبگيري از رقتهاي الکلي عبور مي دهيم و در آخر نيز آنها را در زايلون براي شفاف شدن قرار مي دهيم و براي مونته کردن از چسب انتلن استفاده مي کنيم.