فعال كردن جهش‌ها در ژني كه kir6.2 زير گروه مسير ـ پتاسيم حساس به ATP و ديابت دوره‌ي نوزادي را كدگذاري مي‌كند و به رمز درمي‌آورد

چكيده

پيشينه تحقيق

بيماران ديابتي دوره نوزادي معمولاً در 3 ماهه اول زندگي داراي چنين عارضه‌اي مي‌شوند و نيازمند به درمان اسنولين دارند. در بيشترم موارد، دليل ناشناخته‌اي مي‌باشد. از آنجا كه مسيرهاي پتاسيم حساس به ATP (k_ATP) در ميان ترشح انسولين تحريك شده بوسيله گلوكز از طريق سلول‌هاي بتاي وابسته به لوزالمعده قرار دارد، ما فرض مي‌كنيم كه فعال كردن جهش‌ها در ژني كه زيرگوره kir6.2 اين مسير را كدگذاري مي‌كند، باعث ديابت‌هاي دوره‌ي نوزادي مي‌شود.

مواد و روش‌ها

ما ژن kCNJII را در 29 بيمار با ديابت‌هاي دوره‌ي نوزادي ثابت و دائمي ترتيب داديم. عكس‌العمل تراوش انسولين نسبت به گلوكاكن سياهرگي، گلوكز و تولبوتاميد در بيمارها و بيماراني ارزيابي شده كه داراي جهش‌هايي در ژن بودند.

نتايج

شش جهش دوتخمكي جديد در 10 نفر از اين 29 بيمار مشخص شد. در دو بيمار ديابت از نوع خانوادگي بود و در 8 نفر ديگر ديابت از جهش‌هاي خود به خودي بوجود آمد. ديابت‌هاي دوره‌ي نوزاديشان بوسيله كتواسيداسيس مشخص شد يا اينكه بوسيله افزايش در قند خون مشخص شد و سپس با انسولين درمان شد. بيماران انسولين را در عكس‌العمل نسبت به گلوكز يا گلوكاگون ترشح نكردند، اما در عكس‌العمل نسبت به تولبوتامين انسولين ترشح كردند. 4 نفر از بيماران همچنين داراي تاخير پيشرفتي وضعيت ماهيچه‌اي بودند، 3 نفر از آنها صرع داشتند و داراي ويژگي‌هاي كژريخت خفيف بودند. زماني كه معمولترين جهش‌ها در kir6.2 با دريافت كننده‌ي سولفونيلورياي 1 در اووسيت‌ها Xenopus laevis نشان داده مي‌شود، توانايي ATP براي سد كردن مسيرهاي k_ATP جهش يافته به طور زياد كاهش پيدا مي‌كند.

نتيجه‌گيري

جهش‌هاي فعال كننده هتروزيگوت در ژن كدگذار kir6.2 باعث ديابت دوره‌ي نوزادي دائمي مي‌شود و همچنين ممكن است با تاخير پيشرفتي، ضعف ماهيچه‌ها و بيماري صرع همراه باشد. تعيين دلايل ژنتيكي ديابت‌هاي دوره‌ي نوزادي هميشتي و دائمي ممكن است درمان اين بيماران را با سولفوني لوريا آسان كند. ديابت‌هاي دوره‌ي نوزادي ممكن است به عنوان افزايش قند خون نياز به انسولين تعريف شود كه در سه ماهه اول دوره زندگي تشخيص داده مي‌شود. اين ممكن است موقتي باشد (در مانگين 3 ماه از بين مي‌رود) يا اينكه ممكن است دائمي باشد كه نيازمند درمان با انسولين در طول زندگي باشد. پيشرفت اساسي در فهم ما از ديابت‌هاي دوره‌ي نوزادي موقت مي‌باشد كه بيشتر موارد آن قابل استناد به يك ناهنجاري‌ در مناطق نقش‌پذير كروموزوم 6 مي‌باشد. در بيشتر بيماران، دليل ديابت نوزادي دائمي ناشناخته مي‌باشد. جهش‌هاي هتروزيگوت تركيبي و هموزيگوت در ژن كدگذار گلوكوگيناز براي موارد معدودي تخمين زده مي‌شود.

ژن‌ها براي وضعيت‌هاي چند سيستمي و نادر كه شامل ديابت‌هاي نوزادي مي‌شود، شناخته و تعيين شده است. مسيرهاي پتاسيم حساس به ATP (k_ATP) نقش مركزي در ترشح انسولين متحرك شده بوسيله گلوكز از سلول‌هاي بتاي وابسته به لوزالمعده بازي مي‌كند. ترشح انسولين بوسيله بسته شدن كانال‌ها شروع مي‌شود و بوسيله‌ي باز شدنشان منع مي‌شود (شكل 1). مسرهاي k_ATP سلول بتا پيچيدگي اكتامتريك را شكل‌گيري منفذي اصلاح كردن سولفوني لوريا تنظيمي زيرواحدهاي كانال پتاسيم باطناً و 4 زيرواحد دريافت كنند مي‌باشد (SUR1). در دوره‌ي kir6.2 و SUR1 براي تنظيم متابوليكي صحيح كانال و مسير موردنياز مي‌باشد. ATP كانال و مسير را به وسيله اتصال به kir6.2 مي‌بندد و نوكلئوتيدهاي منيزيم (Mg-ATP, Mg-ADP) فعاليت مسير را بوسيله فعل و انعال داخلي با SUR1 تحريك مي‌كند. سولفوني لوريا ترشح انسولين را در ديابت نوع 2 بوسيله اتصال به SUR1 و بوسيله بستن كانال و مسيرهاي k_ATPبوسيله يك مكانيزم غير مستقل از ATP تحريك مي‌كند.

ما فرض مي‌كنيم كه فعال كردن جهش در ژن كدگذار زيرواحد kir6.2 مسير k_ATP سلول بتا (kCNJII) باعث ديابت‌هاي بوجود آمده از پدر و مادر مي‌شود، زيرا غيرفعال كردن جهش‌ها در اين ژن منجر به ترشح انسولين كنترل نشده و ازدياد انسولين مادرزادي مي‌شود. فنوتيپ‌هاي مقايسه‌اي ديابت‌هاي دوران نوزادي دائمي و ازدياد انسولين با فعال و غيرفعال كردن جهش‌ها به ترتيب از ژن كدگذار گلوكوكيناز ديده مي‌شود. حمايت قوي از اين نظريه و فرضيه به خاطر مشاهده‌اي مي‌باشد كه از موش‌هاي مهندس ژنتيك شده (ترانسژنيك) با مسيرهاي k_ATP سلول بتا به دست آمده است كه اين داراي ديابت هاي دوره‌ي نوزادي عميق مي‌باشد. بنابراين ما فرض ژن كدگذار  kir6.2را در بيماراني كه داراي ديابت‌هاي دوره‌ي نوزادي دائمي بودند يا در ديابت‌هاي بلوغي توارثي نوجوانان (MODY)، توالي داديم.

بيماران

ما DNAي 29 پروباند را به ديابت‌هاي دوره نوزادي دائمي، از جمله بين‌المللي براي مجموعه ديابت‌هاي نادر نوجوانان و كودكان (ISPAD)، توالي داديم. بيماران در مجموعه براي مطالعه بين سپتامبر 2001 و اكتبر 2003 ثبت شدند. بيماران با ناهنجاري‌هايي در كروموزوم G24 جهش‌هايي در ژن كدگذار گلوكوناز، نارسايي لوزالمعده‌اي بدون‌تراو، شامل اين مجموعه شدند. همچنين ما DNAي 15 پروباند را با MODY از خانواده‌هاي انگليس ترتيب داديم كه در آنها جهش‌ها در شش ژن مربوط MODY شناخته شده ممنوع‌الورود شده بود. رضايت اطلاعي كتبي از همه بيماران يا والدينشان گرفته شد.

آناليزهاي جهشي

منطقه رمزگذار و اينترون مرز اگزوزي jGNJII از DNA ژنومي بوسيله عكس‌العمل زنجيره‌ي پليمراز با استفاده از پرايمرها (جلودارها)ي توضيح داده شده قبلي علاوه بر قطعه‌ي 5R5'CTGTGGTCCTCATCAA به قطعه‌ي 6R5'CCACATGGTCCGTGTGIACAACACG' وسعت داده شد. محصول بوسيله روش‌هاي استاندارد متوالي شد. ارتباطات خانوادگي با استفاده از يك صفحه از 10 نشانگر (علامت) ريزماهواره تاييد شد.

مطالعات باليني

همه بيماران با جهش در ژن كدگذار kir6.2 تحت آزمايشات باليني قرار گرفتند كه شامل پيشرفت‌هاي معضل و ارزيابي‌هاي عصب‌شناسي بوسيله يك پزشك يا پزشك متخصص اطفال كودكان بود و نتايج باليني بررسي شد. ثبت ضربان قلب بوسيله برق براي اثبات نامنظمي ضربان قلب و براي اندازه‌گيري فاصله QT آزمايش شد. همه تست‌هاي فيزيولوژيكي بعد از اينكه بيماران در طي شب چيزي نخوردند، اجبار شد. يك تست تحريك گلوكاكن به صورت زير انجام شد:

15mg گلوكاگن در هر كيلوگرم وزن بدن (اندازه معين ماكزيمم، 1mg) در زمان صفر به طور درون وريدي داده شد و نمونه‌هاي خون براي اندازه‌گيري سي‌پپتيت C-10, 5, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 15 و 20 دقيقه به دست آورده شد. سپس بيشترين مقدار سي‌ ـ‌ پپتيد ثبت شد. يك تست تلرانس ـ‌ گلوكز درون وريدي نمونه‌برداري شده‌ي تغيير يافته‌ي تولبوناميد همان طور كه قبلاً توضيح داده شد، به اجرا درآمد. بعد از نمونه‌برداري خطي ـ بازي، يك قطعه كوچك و گرد 3 ميلي‌گرم از تولبوتاميد در هر كيلوگرم، 20 دقيقه‌ي بعد دنبال شد. ما جواب انسولين افزايشي اوج را بعد از قطعه‌ي كوچك و گرد گلوكز و قطعه كوچك و گرد تولبوتاميد محاسبه كرديم.

مطالعات كاركردي

موشه گونه وحشي kir6.2 يا 6.2 كه در آن هيستيدين جايگزين آرگينين در موقعيت 201(R201H) شد با موش صداي SUR1 (كه شامل اگزون 17 مي‌شود) در اوويست‌هاي Xenopus laevis نشان داده شد و جريانات k_ATP همان طور كه قبلاً توضيح داده شد، ثبت شد. براي شبيه‌سازي تاثير هيتروزيگوسي، ما اووسيت‌ها را با SUR1 و يك تركيب 1:1 از kir6.2 و RNA (mRNA) پيك kir6.2 R201H تزريق كرديم. منحني‌هاي عكس‌العمل غلظت ATP بر اساس معادله‌ي I/I_c=1+[1+[ATP]/I₅₀O^h]^Hill تجهيز شد كه در آن I جريان، k_ATP، I_c جريان نبود نوكلئوتيد، [ATP] غلظت ATP، IC₅₀ غلظت ATP مي‌باشد كه در آن مهار نصف ماكزيمم مي‌باشد و h ضريب هيل (Hill) مي‌باشد. اطلاعات به عنوان ميانگين‌هاي ISE داده شده است.

آناليز جهشي

ما 6 شكل هيتروزيگوس جديد را در ژن كدگذار kir6.2 در 10 عدد از 29 پروباند كه داراي ديابت دوره‌ي نوزادي دائمي بودند، تعيين كرديم. جهش‌‌ها يك جانشين گلوتامين به آرگينين در موقعيت (Q52R) 52 يك جانشين جايگزين والدين به گليكين در موقعيت (759G) 59 يك جانشين والدين به متي‌اينن در موقعيت (759M) 59، جانشين آرگينين به هيستيدين در موقعيت (R201H) 201، يك جانشين آرگينين به سيستين در موقعيت (R201C) 201 و يك جانشين ايزوليسين به ليسين در موقعيت (1296L) 296 بود. هيچ جهشي در هيچ از پروباندهاي داراي MODY پيدا نشد. جهش Missense (نوعي از جهش در DNA كه در پي آن يك باز نوكلئوتيدي با يك باز ديگر تعويض شد و اين امر سبب تغيير رمز اختصاصي يك اسيد آمينه با رمز اسيد آمينه ديگر شد. در نتيجه يك پلي پپتيد غيرطبيعي حاصل مي‌شود).

R201H در 4 عدد از اين پروباندها تعيين شد و جههش V59M missense در 2 يافت شد. در همه خانواده‌ها ديابت‌هاي دوره نوزادي تنها در اشخاصي ديده شد كه داراي جهش‌هاي kir6.2 بودند و كساني از افراد خانواده كه داراي اين جهش‌ها نبودند، ديابتي نبودند (شكل 2). در دو خانواده (ISPAD19, BRI) ديابت‌هاي دوره نوزادي از والدين مبتلا به فرزندانشان انتقال پيدا كرد. از آنجا كه هر دو انتقال پدري و مادري مي‌تواند اتفاق بيافتد، نقش‌پذيري جايگاه (لوكوس) غيرمحتمل مي‌باشد. در مورد، DNA از 2 والدين تحت تاثير قرار نگرفته در دسترس بود و صفات پدري ايجاد شد، جهش‌ها به طور خود به خود افزايش پيدا كرد.

هيچكدام از جهش‌ها در 100 فرد غيرديابتي از انگليس نشان داده نشد. شكل 3، محل باقيمانده‌هاي جهش يافته را در kir6.2 نشان مي‌دهد. همه باقيمانده‌هاي جهش يافته در بين انسان‌ها، موش‌هاي صحرايي، موش‌ها و خوك‌هاي بزرگ امريكايي نگهداشته شد. باقيمانده آرژينين در موقعيت 201 در ميان 10 عضو خانواده‌ي مسيرهاي kir نگهداشته مي‌شود. يافته‌اي كه از اين احتمال حمايت مي‌كند، باقيمانده (پسمانده) نقش حياتي در عملكرد مسير و كانال دارد. علاوه بر اين، ما چندين پلي‌مراز مشخص شده‌ي قبلي را تعيين كرديم (يك جانشين اسيد گلوتاميد به ليسين در موقعيت 23[E23K]، يك جانشين آلانين به آلانين در موقعيت 190[A190A]، يك جانشين لسين به ليسن در موقعيت 267[L267L]، يك جانشين لسين به والين در موقعيت 270[L270V]، يك جانشين ايزوليسين به والين در موقعيت 337[I337V]، يك جانشين ليسين به ليسين خاموش در موقعيت 381[K381K] و يك جايگزين سرين به سيستين در موقعيت 385[S385C].

خصوصيات باليني

خصوصيات‌هاي باليني بيماران با جهش‌ها در جدول 1 نشان داده مي‌شود. 2 زيرگروه از بيماران وجود دارد: آنهايي كه تنها ديابت دارند و آنهايي كه هم ديابت دارند و داراي ناهنجاري‌ عصبي مي‌باشند. ديابت‌ها و وزن توليد پايين بر ترشح انسوليني بعد از تولد و ترشح انسولين در درون رحمي معيوب تاثير مي‌گذارد و در هر دو گروه بيماران مشابه بوده است.

ديابت‌ها

ديابت‌ها در ميانگين 7 هفته (دامنه، توليد تا 26 هفتگي) مشخص مي‌شود. در تشخيص، همه بيماران داراي افزايش قند مشخص (غلظت قند خون، 270 تا 972 ميلي‌گرم در هر دسي‌ليتر [15 تا 54 ميلي‌مول درهر ليتر]) و 3 نفر از آنها كتوراسيدوز داشتند. هيچكدام از بيماران داراي غلظت‌هاي بالا رفته‌ي اوتو آنتي‌بادي‌هاي مربوط به نوع 1 ديابت نبودند و غلظت سي‌پپتيد معمولاً كمتر از pmol200 در هر ليتر بود. دوز ميانگين انسولين 87/0 در هر كيلوگرم بود (دامنه 3/0 تا 3/1). تنها يك مريض (پدر پروباند در خانواده‌ي BR1) با انسولين معالجه نشد. اوتولبوتاميد را از بچگي دريافت كرده بود و در سن 46 سالگي، كنترل خوبي از مريضش با اين تجويز داشت (سرعت بخشيدن به غلظت گلوكز، 10 ميلي‌گرم در هر ليتر [1/6 ميلي‌مول در ليتر]، غلظت سي‌پپتيد، pmol400 در هر ليتر).

وزن تولد پايين

وزن تولد پايين يك ويژگي همه بيماران بود. در 7 نفر از 12 بيمار (58 درصد) وزن توليد پايين‌تر از درصد سوم بود. در بيماراني كه داراي علائم عصبي نبودند (جدول 1). رشدي براي تحرك بيشتر براي عقب ماندگي مشخص از خود نشان دادند و وزن قدشان بعد از ميانگين 3/9 سال در تشخيص يا درمان توزيع شد.

خصوصيات عصبي

3 بيمار (پروباندها در خانواده ISPAD43, ISPAD27, ISPAD25) داراي ناهنجاري‌هاي عصبي مشابه بودند كه فتوتيپ‌هاي لوزالعمعده اضافي مربوط به جهش kir6.2 را نشان دادند (جدول 1). هر 3 بيماري داراي خصوصيات كژريختي، بيهوشي، ضعف ماهيچه‌ها و بيشتر تاخيري مشخص همراه با ديابت دوره كودكي بودند. بيمار ديگر (پروباند در خانواده‌ي ISPAD55) داراي فتوتيپ حد واسط بود كه در تاخير پيشرفتي و ضعف ماهيچه‌ها علاوه بر ديابت‌هاي دوره نوزادي درگير بود، اما در ويژگي‌هاي عصبي ديگر درگير بود. هيچ دليلي به جاي جهش kir6.2 براي مشكلات عصبي پيدا نشد. همه كودكان داراي كاريوتيپ‌هاي زمان بودند. بيماران ديگر داراي پيشرفت نرمال بودند كه نشان مي‌داد همه جهش‌ها در kir6.2 با ناهنجاري‌هاي عصبي در ارتباط نيستند.

تاخير پيشرفتي

همه چهار مريض با خصوصيت‌هاي عصبي مشترك براي رسيدن به مرحله‌هاي اجتماعي، عقلاني و حركتي مناسب براي سنشان موفق نشدند. تاخير حركتي مشخص‌ترين اين ويژگي‌ها بود. مسن‌ترين كودك قادر به راه رفتن بدون كمك در بين 17 سالگي نبود و 4 كودك پيشرفت حركتي را نشان دادند كه سن زماني آن كودكان يا جوان‌تر تطابق داشت. ضعف ماهيچه‌اي در آزمايشات عصبي در 4 مورد وجود داشت: غلظت كينازكريتين در همه آنها نرمال بود. نمونه‌هاي بافت‌برداري ماهيچه‌اي كه از دو بيمار بدست آمد، نرمال بود و برق‌نگاري ماهيچه كه در 2 نفر اجرا شد، تاييد كرد كه جريان عصبي نرمال بوده است. در عملكرد يك بيمار پتانسيل‌ها مدت و دامنه كاهش يافته ناخوشي ماهيچه‌ را نشان مي‌دهد. پيشرفت زبان و ماهيچه‌اي همچنين به طور مشخص در اين 4 بيمار به تاخير افتاده بود هيچكدام تصويرنگاري زرونانس مغناطيسي (MRI) و مطالعات پرتونگاري مقطعي محاسبه شده كاهشي در اندازه‌ي پوسته و غشاي مخچه نشان نداد. هيچ ناهنجاري ساختاري ديده نشده، صرف نظر از اينكه زخم‌هاي غيرمعين، كوچك در سرتاسر ماده‌ي سفيد در يك مريض (پروباند در خانواده‌ي ISPAD43) روي يك اسكن MRI زماني كه 14 ساله بود، به دست آورده شد.

بيماري سرع (بيهوشي)

حملات عمومي، پيچيده يا ميوكلونيك در 3 بيمار (پروباند در‌ خانواده‌ي ISPAD43, ISPAD27, ISPAD25) كه اولين سال دوره‌ي زندگي‌شان را مي‌گذرانند، مشاهده شد. حملات به تجويز و داروي ضدغشي و ضدبيهوشي جواب داد (ويگباترين در دو مريض دولپوريت سديم در يك نفر). حملات قبل از كمي قند خون شناخته شده از نظر پزشكي مي‌باشد. همه‌ي نگاره‌هاي مغزي فعاليت غيرعادي را با موج‌هاي تند 2 طيفه نشان مي‌دهد. يك مريض كه داراي هيچ سارتيماي مشخص بود، به ويگاباترين جواب داد. ويژگي‌هاي كژريخت به همه بيماران داراي صرع يا غش داراي ويژگي‌هاي كژريخت خفيف مي‌باشد. شكل ظاهري آنها بوسيله درز جنيني برجسته، دهان انقبضات اندامي بودند كه در دو نفر در توليد و در يك نفر در 4 سالگي مشخص شد.

مطالعات فيزيولوژيكي

هم در طي صيام و هم بعد از تحريك گلوكاگن، غلظت سي‌ ـ پپتيدسرم به طور عمومي كمتر از pmol200 در هر ليتر با وجود افزايش قند خون مشخص بود. يك نتيجه سازگار با كار معمول و غيرعادي سلول بتاي برجسته (جدول 1). سرم سي‌پپتيد از حد پايين‌تر دامنه‌ي زمان تنها در 3 مريض تجاوز كرد (2 كودوك معالجه شده با انسولين و افراد با لغي كه ديابتشان با تولبوتاميد كنترل شده بود) (جدول 3). 3 بيمار كه داراي جهش‌هاي موثر بر باقيمانده 201 بودند، داراي ترشح انسولين كميته در عكس‌العمل به گلوكز وريدي بودند، اما انسولين را در عكس‌العمل و جواب به تول بوتاميد ترشح كردند (شكل 4).

آناليز عملكردي جهش R201H

زماني كه kir6.2 گونه وحشي SUR1 در اوويست‌هاي X. leavis نشان داده شد، جريانات k_ATP تقريباً به خاطر مهار بوسيله‌ي غلظت‌هاي ATP درون سلولي بالا غيرقابل يافت بود، اما مي‌توانستند بوسيله آزيد كه غلظت‌هاي ATP سيتوزوليك را پايين مي‌آورد، فعال شوند (شكل 5A). در مقابل جريان استراحتي مهم از اووسيست‌هاي نشان دهنده‌ي kir6.2, R201H, SUR1 ثبت شده (p<0.01 براي مقايسه با گونه وحشي kir6.2). اين جريانات بيشتر بوسيله azide فعال شد (p<0.5 براي مقايسه با گونه وحشي 5C, 5B).

اطلاعات نشان مي‌دهد كه متابوليسم باعث انسداد كمتر مسيرها و كانال‌هاي kir6.2, R201H, SUR1 نسبت به مسيرهاي k_ATP گونه وحشي مي‌شود. براي جستجو كردن مكانيزم‌هاي تحت اين نتايج، ما حساسيت نوكلئوتيد گونه وحشي و كانال‌هاي جهش يافته را آزمايش كرديم (شكل 5D). مسيرهاي kir6.2, R201H, SUR1 به طور قابل ملاحظه حساسيتشان كمتر از مسيرهاي گونه وجشي براي ATP درون سلولي بوده است، مسيرهاي جهش يافته به اندازه نصب ماكزيمم در يك غلظت ATP از 262±33μmدر مقايسه با غلظت ATP از 7±1μm براي مسيرهاي kir6.2, SUR1 (p<0.001) (شكل 5E) انسداد شدند.

با وجود اين مسيرهاي جهش يافته بوسيله Mg-ADP تا حد محدودي فعال شدند. ميزان هدايت مسير تك و كسر زماني كه مسير در وضعيت و حالت باز مي‌گذراند (احتمال باز) نرمال بود. براي شبيه‌سازي اثر هيتروزيگوسي، ما اووسيت‌ها را با SUR1 و مخلوط 1:1 از kir2 و  kir6.2, R201H, mRNA تزريق كرديم. جريان راكد اوويست‌ها كه به تركيب 1:1 تزريق شده به طور جزئي و نه خيلي برجسته بزرگتر (0.27±0.7nA) از اوويست‌هاي با كانال گونه وحشي (p=0.2)(0.13±0.05nA) بود (شكل 5C). جريانات k_ATPكانال‌ها و مسيرهاي جهش يافته بيشتر بوسيله azide فعال مي‌شدند و بوسيله تولبوتاميد تا حد مشابه مسير گونه وحشي انسداد شدند.

حساسيت ATP همچنين به مسير گونه وحشي با يك مقدار IC₅₀ از 7.6±0.4μmنزديك بود (شكل 5E). با وجود اين جريان‌هاي k_ATP از مسيرهاي جهش يافته به طور برجسته بزرگتر از جريان‌هاي k_ATP در مسيرهاي گونه وحشي در غلظت‌هاي ATP از 1μm (p=0.008) به خاطر اختلاف در ضريب هيل بودند.د

بحث و تشريح مطالب

نتايج ما نشان مي‌دهد كه هيتروزيگوس فعال كننده‌ي جهش‌ها در ژن رمزگذار زير واحد kir6.2 از مسير k_ATP مي‌تواند باعث هر دوي ديابت‌هاي دوره‌ي كودكي دوره‌اي و خانوادگي شود. اين زيرنوع ژنتيكي ممكن است به طور نسبي دليل رايج ديابت‌هاي دوره‌ي نوزادي دائمي، از زماني كه آن را در 34 درصد پروباندها پيدا كرديم، باشد. بعضي از بيماران با جهش‌هاي موجود در ژن كدگذار kir6.2 داراي غش، ضعف ماهيچه، تاخير پيشرفتي مشخص علاوه بر ديابت دوره‌ي نوزادي هستند. اين مشاهدات با نقش حياتي مسيرهاي k_ATP در سلول‌هاي بتاي وابسته به لوزالمعده اشاره مي‌كند و نقشي را در ماهيچه‌هاي بشر و مغز بشر نشان مي‌دهد. مداركي كه نشان مي‌دهد اين جهش‌ها سيي هستند، خيلي قوي مي‌باشد. آنها با ديابت‌ها در 2 خانواده با انتقال عمودي جداسازي شدند و موارد غيرخانوادگي در ديابت‌ها به جهش‌هاي خود به خودي مربوط بودند (از آنجا كه جهش در ديابت‌ها والدين نورموگسيميك موجود نبود)، تقريباً 106 نفر مردم احتمالاً داراي جهش خود به خودي در يك ژن اين اندازه مي‌باشند.

بنابراين در 9 تا از چنين جهش‌هايي دور از احتمال است كه مشاهده فرصتي باشند. رايج‌ترين جهش (كه منجر به جايگزيني R201H مي‌شود)، درون نوكلئوتيد CPG با يك نقطه داغ براي جهش‌ها در ژن‌هاي پستانداران اتفاق مي‌افتد. اين احتمال كشف و يافت برگردند، جهش R201H را در خانواده‌هاي غيرمرتبط از كشورهاي مختلف نشان مي‌دهد. از آنجا كه اكثريت جهش‌ها خودبه خودي هستند، پيشينه خانوادگي ديابت اغلب موجود نمي‌باشد. ديابت به طور ميانگين در سن 7 سالگي و در طي 3 ماهه اول دوره زندگي 10 تا 13 بيماري مشخص شد اگرچه 3 بيمار با كيتواسنيوز مشخص شدند، احتمال دارد كه حداقل بعضي از بيماران داراي ترشح كمينه انسولين درون‌زاد داشتند، زيرا در اكثر بيماران مريضي فوراً بعد از تولد مشخص نشد و بعضي داراي غلظت‌هاي سي ـ پپتيد قابل كشف بودند. بيماران با جهش‌هاي kir6.2 ممكن است با نوع ديابت 1 بر حسب ويژگي‌هاي باليني تطابق و همپوشاني داشته باشند، اما 9 نفر از بيماران دارا اتو آنتي‌بادي سلول بتا بودند.

حدي كه جهش‌ها در ژن كدگذار و رمزگذار براي ديابت نوع 1 منفي آنتي‌بادي محاسبه مي‌شوند، به تحقيقات و جستجو نياز دارد. تاخير رشد درون رحمي شديد يافت شده در بيماران با جهش kir6.2 به طور زياد با ترشح انسولين غايت يا كاهش يافته در رحم سازگار مي‌باشد و همچنين در بيماران با عيوب گلوكوكيناز، فقدان منطقه نقش‌پذير شده‌ي كروموزوم 6.624 (كه منجر به ديابت دوره‌ي نوزادي موقت مي‌شوند)، ديده مي‌شود. رشد تحرك بيشتر براي جبران عقب‌ماندگي پس از تولد يكي از ويژگي‌هاي اين وضعيت‌ها مي‌باشد. همچنين در بيماران با جهش‌هاي kir6.2 كه داراي ناهنجاري‌هاي عصبي نبودند، مشاهده شد. جهش‌ها در ژن كدگذار kir6.2 احتمالاً باعث ترشح كاهش يافته انسولين از سلول‌هاي بتا بوسيله حساسيت كاهش يافته به ATP مي‌شود كه پيش‌بيني مي‌شود منجر به بدست آوردن عملكرد مسير مي‌شود آناليز عملكردي رايجترين جهش (R201H)‌ نشان داد كه جهش هموزيگولين منجر به حساسيت كاهش يافته‌ي نسبت به ATP مي‌شود. زماني كه گونه وحشي و زيرواحدهاي جهش براي شبيه‌سازي وضعيت هيتروزيگولين با هم اظهار مي‌شوند، حساسيت ATP جمعيت تركيب شده مركب مسيرهاي هيترومتريك بجز در غلظت‌هاي ATP پايين شبيه به گونه وحشي بود.

با وجود اين ما انتظار داريم كه جمعيت كوچكي از مسيرهاي R201H همومتريك با حساسيت ATP پايين‌تر خواهد بود (در حدود 6 درصد مسيرها اگر شمار زيرواحدهاي جهش يافته در مسير تترامتريك به صورت دونامي توزيع شود). در حقيقت چنين مسيرهاي حساس به ATP در سطح مسير تك (كانال تك مسيره) مشاهده شد. اگرچه اندازه‌گيري اين جريان در غلظت‌هاي ATP بالا سخت مي‌باشد، ممكن است نگهداري سلول بتاي هايپرپلاريز شده حتي در وجود گلوكز كافي باشد كه بوسيله آن فعاليت الكتريكي و آزادسازي انسولين كاهش پيدا مي‌كند.

نتايج ما نشان مي‌دهد كه خيلي از تغييرات كوچك در جريان k_ATP ساكن كه به خاطر تغييرات كوچك در حساسيت ATP مي‌باشد، مي‌تواند ترشح انسولين را براي ايجاد ديابت در افراد معيوب كند. اين يافته با بعضي سازگار مي‌باشد نه با همه. مطالعات نشان مي‌دهد كه پلي‌مورفيزم kir6.2 كه در آن ليسين جايگزين اسيد گلوتاميك در موقعيت 23 (E23K) مي‌شود. تغييرات كوچكي در حساسيت ATP نشان مي‌دهد. مدل مولكولي انتهاي C از kir6.2 پيش‌بيني مي‌كند كه R201 نزديك زنجيره فسفات ATP قرار دارد و با فسفات ATP تقابل دارد. مفهوم نقش حياتي براي باقيمانده‌ي 201 در اتصال ATP بوسيله اين بافت حمايت مي‌شود كه حساسيت ATP از مسيرهاي k_ATP زماني كه آرژينين در موقعيت 201 نسبت به هيستيدين و ديگر باقيمانده‌ها جهش پيدا مي‌كند، كاهش پيدا مي‌كند.

3 جهت (759G, 759M, Q52R) در مارپيچ لغزشي پيدا مي‌كند. باقيمانده 52 در انتهاي مارپيچ و باقيمانده 59 در وسط در امتداد طول قرار دارد. موقعيت مارپيچ لغزش نقشي را در تنظيم ورودي مسير و كانال نشان مي‌دهد، اما دور از محل اتصال ATP قرار دارد، كار ديگري براي توضيح دادن مكانيزم لازم است كه بوسيله آن جهش در دامنه و حيطه مارپيچ لغزشي موثر بر بيماري قرار دارد. تعيين جهش‌ها در ژن رمزگذار زيرواحد مسير k_ATP، kir12 كاربردهاي مهمي براي درمان بيماران مبتلا ممكن است داشته باشد.

مطالعات عملكردي ما در شرايط vitro نشان مي‌دهد كه اگر مسير k_ATP بتواند بوسيله مكانيزم غيرمستقل ATP نزديك شود (براي مثال سولفونيلوراز) ترشح انسولين ممكن است برگردانده شود. بيماران با جهش‌هاي موثر بر موقعيت 201، عكس‌العمل انسوليني زيرنرمال، اما واضحي نسبت به تولبوتامين درون ورودي داشت. اين مشاهده نشان مي‌دهد كه وضعيت فاتوفيزيولوژ يكي در انسان يافته‌هايي را در ويترو بازتاب مي‌كند كه امكان استراتژي‌هاي درمان جديد را بر اساس سولفونيلوراز يا مهاركننده‌هاي مسيري k_ATP ويژه ديگر را در بيماران وابسته به انسولين بالا مي‌برد. در ميان يادداشت‌هاي يك بيماري با جهش R201H كه هميشه با تولبوتاميد درمان مي‌شد، سطوح سي‌پپتيد ر حيطه نرمال و كنترل گلكميك خوبي داشت.

تحقيقات بيشتري براي تعيين اينكه آيا تشخيص جهش در ژن رمزگذار kir6.2 اجازه درمان را نسبت به فرم عوامل دهاني به جاي تزريق انسولين زيرپوستي خواهد داد يا نه؟ مورد نياز مي‌باشد. غيرمحتمل است كه تاخير پيشرفتي شديد، ضعف ماهيچه و بيهوشي ديده شده در يك گروه از بيماران با جهش‌هاي kir6.2 از ديابت يا درمانش نتيجه شود. تاخير پيشرفتي شديد و بيهوشي (صرع) مزمن در كودكان با ديابت دوره‌ي نوزادي نادر مي‌باشد. در مطالعات ما، تشخيص عصب‌شناسي كه بيشتر از شناختن افزايش قند خون بود و انقباض ديدهه شده در تولد در 2 بيمار، نشان مي‌دهد كه بركار عصبي در رحم موجود بود. kir6.2 زيرواحد تشكيل دهنده متصدي در مسيرهاي k_ATP در ماهيچه اسكلتي و نرون‌ها در كل مغز مي باشد. با وجود اين فعاليت تغيير يافته اين مسيرها مي‌تواند باعث تاخير پيشرفتي، ضعف ماهيچه‌اي و بيهوشي و غش شود.

مطالعات در نمونه‌هاي حيوانات براي ارزيابي ماهيچه اسكلت و تاثيرات عصبي دستيابي جهش‌هاي عملكردي اجرا شده است. با وجود اين فقدان عملكرد مسير و كانال k_ATP مي‌تواند منجر به حملات القا شده‌ي كاهش اكسيژن بافت شود و القاي بيشتر از حد SUR1 در پيش مغز، مستعد بودن حملات را كاهش مي‌دهد. تحليل و آناليز بيماران اضافي براي تعيين اينكه آيا جهش‌هاي kir6.2 با سندرم مجزاي مشخص شده بوسيله تاخير پيشرفتي، بيهوشي و ديابت‌هاي دوران نوزادي افزايش مي‌دهد يا نه، مورد نياز خواهد بود.

موقعيت و نوع جهش بر فتوتيپ ممكن است تاثير بگذارد. بيمار با جهش در باقيمانده 201 ديابت داشتند، اما ناهنجاري عصبي نداشتند. متغير 759M با هر دوي ديابت مجاز و تاخير پيشرفتي همراه با ديابت رابطه دارد. اين نوع رفتار ژنتيكي ـ كه در آن همان جهش با فتوتيپ‌هاي مختلف در خانواده‌هاي مختلف ارتباط دارد ـ با ژن‌هاي ديگر نظير LMNA مشاهده شده است. جهش‌‌هاي هيتروزيكوس kir6.2 باعث مي‌شود كه ديابت تاييد كند كه مسير وابسته به كانال k_ATP براي ترشح انسولين حياتي مي‌باشد و ديگري، ‌مسيرهاي غيروابسته كانال k_ATP براي جبران فقدان آن ناتوان مي‌باشد. جهش‌ها با تاثير عملكردي با شدت پايين‌تر بوسيله زمينه‌ي ژنتيكي ممكن است منجر به ديابت كوتاه مدت شود يا اينكه منجر به ديابتي شود كه بعد از دوره نوزادي ظاهر مي‌شود.

در حقيقت، ما و ديگران نشان داده‌اي كه kir6.2 رايج پلي‌مورفيزم E23K با حساسيت افزايش يافته نسبت به ديابت نوع 2 در ارتباط مي‌باشد. در نتيجه، جهش‌هاي فعال كننده در ژن رمزگذار زير واحد مسير پتاسيم حساس به kir6.2, ATP باعث ديابت‌هاي دوران نوزادي و در بعضي از بيماران ناهنجاري‌ عصبي مي‌شود. يافته‌هاي اوليه كه در آن توليد تاميد تا حدودي براي تاثير رايجترين جهش روي ترشح انسولين تنظيم مي‌كند، ايجاد اميدواري‌هايي مي‌كند كه به موجب آن حداقل در بعضي موارد از موارد ديابت ممكن است به طور موثر با قرص‌هاي سولفونوي لوريا معالجه شود.

شكل 1، نمايش طرحي سلول بتاي وابسته به لوزالمعده، كه نقش مسير پتاسيم حساس به ATP (k_ATP) را در ترشح انسولين شرح مي‌دهد، ‌گلوكز بوسيله راه انتقال كننده‌ي گلوكز CLUT2 وارد سلول بتا مي‌شود. به محض اينكه گلوكز در درون سلول سلول سوخت و ساز شد، منجر به تغييراتي در غلظت درون سلولي نوكلئوتيد آدنين مي‌شود كه مسير k_ATP را مهار مي‌كند. بنابراين باعث بسته شدن مسير يا كانال مي‌شود. مسير k_ATP شامل 4 زيرواحد دريافت كننده سولفوني لوريا (SUR1) و 4 زيرواحد kir6.2 در يك ساختمان ساخت اتومتريك مي‌باشد. بسته شدن مسير يا كانال منجر به دي پلاريزاسيون غشا مي‌شود كه در پي آن مسيرهاي كلسيم وابسته به ولتاژ (Ca²⁺) را فعال مي‌كند و در برگشت منجر به افزايش در Ca²⁺ درون سلولي مي‌شود كه اگزوسيوس انسولين را راه مي‌اندازد. سولفوني لوريا ترشح را بوسيله اتصال مستقيم به زيرواحد SUR1 مسيرهاي k_ATP آغاز مي‌كند و باعث انسداد مسير مي‌شود. Mg-ADP بر منيزيم ADP دلالت مي‌كند.

شكل 2، وضعيت ديابت و جهش‌ها در ژن كدگذار kir6.2 در خانواده‌ها

اين شجره‌نامه‌هاي جزئي خانواده‌ها را با جهش‌هاي 296L, R201H, R201C, 759M, V59G, Q52R نشان مي‌دهد. در همه شجره‌نامه‌اي كه براي آنها DNA پدر و مادري در دسترس بود، روابط و ارتباطات خانوادگي بوسيله يك صفحه 10 زيرماهواره‌اي تاييد شدند، در شجره‌نامه‌هاي 55, 54, 44, 43, 41, 27, 22, 19 ISPAD جهش‌هاي خود به خودي فقدان ديابت‌هاي دوره كودكي مزمن در والدين و وجود آن در كودك را توضيح مي‌دهد. مربع‌ها نشان دهنده اعضاي مذكر و دايره‌ها نشان دهنده اعضاي مونث خانواده مي‌باشند و براي لوزي‌ها جنسيت تعريف نشده است. مربع‌ها و دايره‌هاي آبي اشخاص با ديابت نوزادي را نشان مي‌دهد. علامت مميز كاهش را نشان مي‌دهد. شماره‌هاي درون لوزي‌ها بر شمار هم‌نژادهاي مبتلا نشده دلالت مي‌كند. يك كد دو حرفي براي وضعيت و حالت ژن‌هاي ناهمسانشان مجاور در زير هر نشان، نشان داده مي‌شود.

N بر اين دلالت مي‌كند كه هيچ جهشي وجود ندارد، M بر جهش و NA براي در دسترس نبودن تست و آزمايش دلالت مي‌كند. P و پيكان به پروباند در هر خانواده اشاره مي‌كند (اولين عضو به كار گرفته شده براي اين مطالعه). اسيد آمينه‌ها بوسيله كدهاي تك حرفي نشان داده مي‌شوند.

شكل 3) شرح 2 زيرواحد kir6.2، جهش‌هاي تعيين شده در بيماران ديابتي دوران نوزادي مزمن را نشان مي‌دهد. اين تشريح بر اساس ساخت بلورين مسير پتاسيم Kirbacle L  مي‌باشد. مارپيچ لغزشي آلفا و فيلتر انتخابي در نارنجي نشان داده مي‌شود و صفحات بتاي انتهاي C در آبي نشان داده مي‌شود. باقيمانده‌ها و تفاله‌هاي متاثر بوسيله جهش‌ها در بيماران ديابتي دوره نوزادي (1296, R201, 759, Q52) در زرد نشان داده مي‌شود. اسيد آمينه‌ها بوسيله كدهاي تك حروفي نشان داده مي‌شود. پيوند سايه‌دار، غشا و پوسته‌ي سلول را نشان مي‌دهد و دايره‌هاي آبي يون پتاسيم را نشان مي‌دهد. برچسب‌هاي خارجي و داخلي به حيطه‌هاي در خارج و بيرون سلول اشاره مي‌كند.

شكل 4) عكس‌العمل‌هاي تراوشي انسولين نسبت به گلوكز درون وريدي و نسبت به تولبوتاميد: نتايج زماني كه راس در سطح انسولين از خط پايه در عكس‌العمل نسبت به 3/0 گرم از گلوكز درون وريدي در هر كيلوگرم و 3 ميلي‌گرم از تولبوتاميد درون وريدي در هر كيلوگرم براي 3 عضو خانواده‌هاي LSPAD، 19 و 41 افزايش پيدا مي‌كند، نشان داده مي‌شود.

شكل 5) تاثيرات مهار سوخت و سازي، يك سولفوني لوريا و ATP درون سلولي روي جريانات در مسيرهاي پتاسيم حساس به ATP جهش يافته و گونه وحشي: جريانات كلي سلولي در يك گيره‌ي ولتاژ 2 الكترودي از اوويست‌هاي سالم و بي‌عيب نشان دهنده‌ي kir6.2, SUR1 (صفحه A) يا kir6.2, R201H, SUR1 (صفحه B) در عكس‌العمل به مراحل ولتاژي ±20mvاز يك پتانسيل نگهدارنده‌ي -10mv ثبت شد. محلول خارجي از 90mM كلريد پتاسيم، 1mM كلريد منيزيم، 1.8mM كلريد سديم و 5mM هپس (7.4pH با هيدروكسيد پتاسيم) به علاوه 3mM آزيد و 500mM تولبوتاميد همان طور كه تعيين شده، تشكيل شده است.

صفحه C نشان دهنده جريان سلولي كل ميانگين فراخوانده شده بوسيله مرحله ولتاژ از 10- تا mv30- در كنترل محلول مي‌باشد. سپس بعد از وضعيت يكنواخت به 3mM آزيد رسيد. سپس به وجود ادامه‌دار آزيد به علاوه 500mM تولبوتاميد رسيد. اوويست‌ها به RNA پيك كدگذار و رمزگذار SUR1 به علاوه kir6.2 (6 اوويست)، kir6.2, H201H (7 اوويست) تزريق شدند. ميله‌هاي T نشان دهنده اشتباه و خطاي استاندارد مي‌باشد.

صفحه D جريان k_ATP ثبت شده را در عكس‌العمل نسبت به سراشيب‌هاي ولتاژ را از 110- تا mv100+ نشان مي‌دهد. خط سايه‌دار شده سطح جريان صفر را نشان مي‌دهد. محلول پپتيت از 140μm كلريد پتاسيم، و 10μmHEPESتشكيل شده است (pH 7.4 با هيدروكسيد پتاسيم)، محلول داخلي شامل 107μmEGTA (اسيد اگزازيك)، HEPES 10μm (pH 7.2 با هيدروكسيد پتاسيم) و ATP 100μm همانطور كه نشان داده شده مي‌باشد.

صفحه E ارتباط بين غلظت ATP و جريان k_ATP را نشان مي‌دهد كه نسبت به جريان در فقدان نوكلئوتيد براي kir6.2, SUR1 در 6 اوويست (دايره‌هاي باز)، kir6.2, R201H, SUR1 در شش اوويست (دايره‌هاي بسته) و يك تركيب 1:1 از kir6.2, R201H و kir6.2  نشان داده شده با SUR1 در شش اوويست (لوزي‌ها) بيان مي‌شود. خطوط بهترين نسبت معادله‌ي Hill براي ميانگين داده مي‌باشد. براي kir6.2, SUR1 مهار آن نصف بيشينه مي‌باشد، غلظت 6.6μm مي‌باشد و ضريب هيل (h) 1:1 مي‌باشد. براي kir6.2, R201H, SUR1، ¹C₅₀مساوي 245μm و h مساوي 2 مي‌باشد.

براي تركيب 1:1 خط بهترين تناسب براي معادله‌ي زير مي‌باشد:

a(1/[1+([ATP]/245μm])+(1-a….) كه در آن [ATP] غلظت ATP، ¹C₅₀ مساوي 7.6μm و a مساوي 04/0 مي‌باشد.